在生物學(xué)巨大進(jìn)步已經(jīng)能夠通過使用熒光顯微鏡。 到目前為止，圖像的分辨率由于物理限制的限制。 在過去的幾年中，新的發(fā)展方式規(guī)避這些限制，并把熒光顯微鏡分辨率的一個(gè)新的水平，提高準(zhǔn)備在科學(xué)熒光顯微鏡。 基態(tài)耗盡其次是個(gè)別分子回報(bào) （GSDIM）是一個(gè)本地化的顯微技術(shù)。 該技術(shù)是能夠解決細(xì)節(jié)小至20納米 。 這使得單一的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物分子在細(xì)胞研究和觀察分子過程。 之一的GSDIM方法比其它定位技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是，它可以用在生物醫(yī)學(xué)研究中常規(guī)應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)熒光標(biāo)記被使用。

定位顯微鏡

常規(guī)熒光顯微鏡圖像的分辨率由衍射到所發(fā)射的光的約一半的波長的限制。 分離被緊密聯(lián)系起來的溶液是需要克服阿貝衍射極限熒光標(biāo)記的結(jié)構(gòu)。 *常見的*分辨方法，成像*越衍射極限的定位顯微鏡，SIM（結(jié)構(gòu)照明）和STED（受激發(fā)射損耗顯微鏡）。

基態(tài)耗盡之后個(gè)別分子回報(bào)（GSDIM）是一個(gè)本地化的顯微技術(shù)。 在一般情況下，定位顯微鏡不看的同時(shí)發(fā)光熒光合奏，但清楚地分開，單獨(dú)的熒光團(tuán)可與納米精度進(jìn)行本地化。 隨著時(shí)間的推移，各熒光團(tuán)標(biāo)記的生物結(jié)構(gòu)的位置被確定，并且基于每個(gè)熒光團(tuán)的位置信息的圖像被重新構(gòu)造，在硅片。 面臨的挑戰(zhàn)是有效地單數(shù)的熒光團(tuán)的合奏，以允許單分子檢測。

GSDIM - 分子基礎(chǔ)

在GSDIM關(guān)鍵的一步是暫時(shí)切換大多數(shù)熒光團(tuán)關(guān)閉，允許單個(gè)熒光團(tuán)的精確定位。 為此，高強(qiáng)度的激發(fā)光被用于在該樣品中，幾乎所有熒光團(tuán)變成暗這樣的方式，只留下單一的，分離良好的熒光團(tuán)發(fā)出熒光，這是納米精度定位的先決條件。 

圖1（右）：基于簡化雅布隆斯基圖上的GSDIM方法的示意圖。 在熒光團(tuán)離域π電子可以是，例如，在地面狀態(tài)S 0>，處于興奮狀態(tài)S 1（兩個(gè)所謂的導(dǎo)通狀態(tài)），或在一個(gè)三重或自由基暗狀態(tài)（均為OFF狀態(tài)）。 當(dāng)熒光燈被發(fā)射時(shí)，電子在地面和激發(fā)態(tài)之間循環(huán)。 不同于這些ON狀態(tài)，在OFF狀態(tài)下的熒光團(tuán)不能發(fā)光。 這些斷狀態(tài)通常是長壽命的，但它們是難以實(shí)現(xiàn)，作為一個(gè)系統(tǒng)間交叉是必需的。 通過設(shè)置合適的環(huán)境條件下，在包埋介質(zhì)，并通過標(biāo)準(zhǔn)熒光團(tuán)對(duì)于免疫熒光的明智的選擇，所以能夠可逆地關(guān)閉的熒光團(tuán)通過激勵(lì)它們與一個(gè)極端的光強(qiáng)度。 當(dāng)足夠的分子處于OFF狀態(tài)時(shí)，它能夠檢測單個(gè)分子的樣品中。

分子狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換

圖2：寬視場與GSDIM。 PTK2細(xì)胞。 NPC染色：抗NUP153 / AlexaFluor 532微管染色：抗β微管蛋白/ AlexaFluor 647禮貌：沃納富凱，徠卡與安娜絲卡和Jan Ellenberg，EMBL，德國海德堡協(xié)作

一旦熒光樣品通過（激光）光激發(fā)，電子被光子一躍成為*激發(fā)態(tài)。上從*態(tài)返回到基態(tài)時(shí)，光略低能量（紅移）射出。 更高的激光功率增大的光子能打到在地面狀態(tài)的電子和電子轉(zhuǎn)移到激發(fā)態(tài)的數(shù)量。 其結(jié)果是，在一給定時(shí)間的基態(tài)和激發(fā)態(tài)之間的采樣周期更多的電子。 發(fā)射的光子數(shù)增加和更亮的樣品可以看到。

激發(fā)光（例如，從高功率激光源）的進(jìn)一步增加可以導(dǎo)致調(diào)光器樣品，由于減少熒光發(fā)射。 在這個(gè)過程的開始，增加激發(fā)光導(dǎo)致許多電子在地面與*激發(fā)態(tài)之間循環(huán)的高。 從激發(fā)態(tài)電子的一定比例進(jìn)入斷電狀態(tài)。 *可訪問的子狀態(tài)從*激發(fā)態(tài)是三重態(tài)。 進(jìn)入三線態(tài)需要一個(gè)自旋翻轉(zhuǎn)電子的。 旋翻轉(zhuǎn)具有非常低的發(fā)生概率，因此是一種非常罕見的事件。 由此關(guān)閉狀態(tài)實(shí)際上是未填充的樣品的低光照射。

關(guān)狀態(tài)有很長的壽命（以μs為s的范圍內(nèi)），并用熒光團(tuán)在關(guān)機(jī)狀態(tài)下的電子不能參與樣品的任何更多的熒光發(fā)射。 隨著時(shí)間的推移越來越多的電子*終在關(guān)斷狀態(tài)，雖然熒光團(tuán)的總數(shù)并沒有改變的樣品顯示暗。 只是“主動(dòng)”或“訪問”熒光數(shù)量已經(jīng)改變。 在關(guān)斷狀態(tài)“泵送”電子可以被看作是一個(gè)可逆開關(guān)。 熒光團(tuán)被關(guān)閉，以電子駐留在關(guān)斷狀態(tài)的時(shí)間。 當(dāng)電子返回到基態(tài)時(shí)，所述熒光團(tuán)被渲染“有效的”，并且可以再次發(fā)出熒光。電子的分子狀態(tài)之間的所有轉(zhuǎn)換是概率管理的進(jìn)程，因此，過渡的確切發(fā)生無法預(yù)測對(duì)于給定的電子。（奧林巴斯顯微鏡）

本地化高達(dá)納米精度

對(duì)*分辨率成像的激光功率保持在一個(gè)較高的水平，直到只有幾個(gè)熒光團(tuán)中的視場發(fā)射光子。“活性”熒光團(tuán)可以循環(huán)到地面和*激發(fā)態(tài)之間的數(shù)千倍，電子返回到關(guān)斷狀態(tài)之前產(chǎn)生的光子的“突發(fā)”。 光子“突發(fā)”被記錄用高敏感的EMCCD相機(jī)。 此外，只有少數(shù)電子填充的基態(tài)的時(shí)間很短，導(dǎo)致“基態(tài)耗盡與個(gè)別分子返回”（GSDIM）的情況。 在一般情況下，熒光團(tuán)發(fā)射的光子的脈沖串在空間上完全分離，這使得在特定區(qū)域中的所有光子的單個(gè)分子的分配。 在這種情況下記錄時(shí)，衍射限制信號(hào)的中心是相同的熒光團(tuán)的位置。 熒光團(tuán)的位置，可以計(jì)算*多納米精度。 

圖3（右）：寬視場與GSDIM。 高爾基體膜蛋白Giantin和高爾基體基質(zhì)蛋白GM130，免疫熒光染色的Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 488，分別。 禮貌靖岡田博士，細(xì)胞生物學(xué)系和解剖學(xué)，醫(yī)學(xué)研究生院，東京大學(xué)，日本。

為什么有機(jī)熒光更好

一個(gè)*分辨率圖像的*終解決取決于）每個(gè)熒光基團(tuán)（定位精度）和本地化的精準(zhǔn)二）個(gè)人熒光標(biāo)記的興趣（染色密度的結(jié)構(gòu)）之間的*小距離。 染色密度可以影響例如通過免疫染色過程中使用更高的抗體濃度。 定位精度取決于來自體熒光收集，并可以用下式來近似的光子數(shù)量：

Δr：顯微鏡/物鏡衍射極限 
N：由一單獨(dú)的局部熒光團(tuán)發(fā)射的光子數(shù) 
Δsms：個(gè)別熒光的定位精度

因此，要實(shí)現(xiàn)10nm的定位精度，400光子必須從用顯微鏡遞送200nm的衍射極限分辨率的熒光收集。 發(fā)射的光子的數(shù)目是在*個(gè)實(shí)例中與包埋介質(zhì)組合的熒光團(tuán)的性質(zhì)。 作為一個(gè)經(jīng)驗(yàn)法則，有機(jī)熒光顯示比熒光蛋白更高的亮度和光穩(wěn)定性。 由此通過這些染料遞送光子的數(shù)目要高得多和定位精度顯著改善。 *后，一個(gè)較好的*分辨率圖像可以與“更強(qiáng)”染料狀有機(jī)熒光團(tuán)由于改進(jìn)定位精度得到！