徠卡顯微鏡共振振鏡掃描儀智能控制
高時(shí)間分辨率顯微鏡 （HTRCLSM），需要快速掃描設(shè)備。而非共振振鏡掃描器允許充分的位置控制，但只是在速度較慢，共振掃描儀允許 ~ 25,000 行每秒，但提供更少定位自由。仍然允許縮放和平移功能，幾種方法都試過，有不同程度的成功。徠卡共聚焦顯微鏡 TCS 系列的使用是非常聰明的解決方案，使與開關(guān)時(shí)間短的無級(jí)縮放。
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"生物學(xué)是一門自然科學(xué)與生命和生物有機(jī)體的研究有關(guān)"是生物學(xué)的維基百科條目的介紹性的句子。而顯微鏡在舊天主要有關(guān)死對(duì)象 （雖然以前還活著），生物顯微鏡的最終目的是，想象生活物體。雖然小生物樣品往往看起來處于非活動(dòng)狀態(tài)，微觀的角度揭示了活躍的活動(dòng)。細(xì)菌有快速移動(dòng)的鞭毛、 細(xì)胞和組織代謝產(chǎn)物顯示速度非?？斓淖兓?小泡運(yùn)輸，非凡的速度和電氣信號(hào)播出由毫秒范圍動(dòng)作電位。為了遵循這些活動(dòng)，我們必須有高的幀速率。共焦顯微鏡在早期的解決方法是引入并行化技術(shù)，例如旋轉(zhuǎn)盤系統(tǒng)，但他們?nèi)狈φ嬲墓步箤游鲂阅堋?/span>單點(diǎn)掃描器提供最佳光學(xué)切片的性能，但通常被認(rèn)為慢。采用諧振振鏡掃描器，現(xiàn)代技術(shù)可以達(dá)到幀速率在每秒 500 的范圍。這篇文章顯示了如何克服這些器件的限制了。
振鏡掃描器 — — 用激光光繪畫
掃描燈現(xiàn)貨在一個(gè)二維的地區(qū)，這束光的角度，改變。這項(xiàng)任務(wù)是通過偏轉(zhuǎn)束的束路徑中插入鏡子很容易解決的。要掃描，鏡像必須是可旋轉(zhuǎn)。黃金標(biāo)準(zhǔn)的旋轉(zhuǎn)鏡是采用什么叫做"振鏡掃描器"。這些設(shè)備有一直在廣泛激光投影儀的激光表演和電影放映。
"檢流計(jì)"一詞起源于電學(xué)計(jì)量。測(cè)量電流，線圈被插入到一個(gè)磁場(chǎng)。一根針的線圈旋轉(zhuǎn)軸上安裝。當(dāng)電流通過線圈，洛侖茲力導(dǎo)致?lián)隙鹊尼槨?/span>較高電流，更廣泛反對(duì)重置撓度力量。撓度可校準(zhǔn)的測(cè)量電流。
另一方面： 如果當(dāng)前已知的一個(gè)人可以創(chuàng)建所需的撓度。為光指向應(yīng)用程序 （掃描儀），針被交換的一面鏡子。當(dāng)一束光打鏡子時(shí)，反射角的改變由兩次的旋轉(zhuǎn)角度。
用于精確定位，旋轉(zhuǎn)角度解碼通過位置傳感器，安裝在旋轉(zhuǎn)桿的另一面。一個(gè)反饋系統(tǒng)控制的驅(qū)動(dòng)電流，以保證的撓度是總是確切地在所需的角度。這允許控制的掃描速度和靜態(tài)定位中所有可用的 xy 平面上的點(diǎn)。這些掃描程序被稱為"閉環(huán)"已關(guān)閉的反饋制度。在成像的應(yīng)用，一種重要的模式是鋸齒掃描。線掃描所需的速度是由執(zhí)行移動(dòng)在一個(gè)方向 （"x") 現(xiàn)貨線性在時(shí)間在所要求的速度。然后，若要重復(fù)掃描，鏡子被搬回最大速度的起始角度。這種模式是可能的慢線頻率作為正弦掃描的替代方法。二維掃描 — — 標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用程序 — — 由垂直地引入第二個(gè)掃描儀的梁路徑生成。這第二個(gè) ("y") 掃描儀生成增量中第二個(gè)軸。顯然，y 掃描儀 （標(biāo)準(zhǔn)條件下） 的速度是 x 掃描儀相比要慢得多，因此，具有更少的限制。
在 ca.500 Hz 線頻率和 512 × 512 像素的全幀，幀速率達(dá)到約一秒。與固定的樣品，這是足夠的時(shí)間分辨率，給出了極大的信噪比。另一方面，當(dāng)成像快速移動(dòng)的物體，幀速率每秒 100 以上期望的 （最好是大約每秒 500）。如果這些圖像是有 10 行，每個(gè)框架 （"地帶掃描"），則需要一個(gè)掃描儀，可以生成每秒 5,000 線。
雖然掃描儀和掃描鏡輕質(zhì)物料制成，都是盡可能的小，他們都是機(jī)械設(shè)備，發(fā)揮顯著的慣性。因此，更高的速度他們只能執(zhí)行正弦掃描。在極端情況下，掃描儀有發(fā)達(dá)的掃描僅在正弦波模式下，只有在它們的共振頻率。像秋千，這些設(shè)備只能改變其振幅 （通過飼養(yǎng)更多的能量) 和他們的階段，與外部標(biāo)準(zhǔn)句號(hào)的位置。目前，與 12,000 赫茲頻率諧振振鏡掃描器是可用的。當(dāng)數(shù)據(jù)記錄在兩個(gè)期間提出和背部訓(xùn)練 （雙向成像），線頻率的成像可以達(dá)到 24,000，對(duì)應(yīng) ~ 45 全幀每秒，對(duì)同頻的最現(xiàn)代的運(yùn)動(dòng)圖片正在使用。在黑暗的一面，這些共振掃描儀有沒有控制的位置和掃描頻率。這種掃描儀提供電磁抽頭的反饋，但這是不太準(zhǔn)確要的任何使用。
圖 1： 最初，靈敏電流計(jì)測(cè)量電流可以在磁場(chǎng)中旋轉(zhuǎn)線圈設(shè)計(jì)。左： 在流動(dòng)的電流通過線圈，洛倫茲力傾斜線圈，并固定在旋轉(zhuǎn)軸的針。傾斜取決于當(dāng)前，其中可以進(jìn)行校準(zhǔn)。
右： 一個(gè)更精確的版本被配備安裝于而不是針軸上一面鏡子。后照準(zhǔn)直的光 （最好的情況： 激光燈） 到鏡子上偏轉(zhuǎn)可以監(jiān)視 (飛行現(xiàn)貨方法) 的屏幕上。
已知的電流應(yīng)用時(shí)，可以控制撓度。一程序的當(dāng)前列火車將導(dǎo)致現(xiàn)場(chǎng)時(shí)空運(yùn)動(dòng)模式。這是振鏡掃描器的工作原理。
視場(chǎng) — — 一個(gè)更好的選擇，比縮放因子
顯微鏡有圓形光學(xué)。當(dāng)你在顯微鏡下看，你看到的是一個(gè)圓。多少您的示例，您可以觀察到在一個(gè)給定的放大是由指定字段數(shù) FN （Sehfeldzahl，SFZ），這是直徑的毫米在目鏡 （中間圖像平面） 的外地平面中的圖像。如果使用帶有字段編號(hào) 25 40 x 鏡頭和目鏡，然后你可以觀察到的實(shí)際面積是 625 μ m 的直徑圓。當(dāng)然，鏡頭有充分糾正來處理這樣一個(gè)大的領(lǐng)域，如果體面成像是物鏡，而通常該字段局限的共焦掃描以確保足夠的圖像質(zhì)量。掃描圖像是通常正方形或矩形。如果掃描的全部字段指定 （例如上述 SFZ 25），然后矩形的對(duì)角線相等的字段編號(hào)，和一個(gè) 40 x 鏡頭會(huì)給作為對(duì)角線 625 μ m。如果掃描一個(gè)正方形，邊緣對(duì)應(yīng)于 442 μ m × 442 μ m。
而不是掃描的全部領(lǐng)域，它是非常簡單的只是通過減少振幅 （伸長率） 的振鏡掃描器掃描它只有一小部分。如果掃描振幅是一半，只有一半各自的維度記錄。正方形的面積然后對(duì)應(yīng)于四分之一的全視場(chǎng)掃描。
仍然，像素?cái)?shù)是相同的和當(dāng)一個(gè)監(jiān)視器上顯示，顯示器的尺寸不會(huì)不改變的當(dāng)然。從本質(zhì)上說，更小的掃描已由兩個(gè)因素生成額外的放大倍數(shù)。這額外的放大倍數(shù)是無級(jí)可調(diào)，稱為"掃描縮放"。它不通過光學(xué)元件，并應(yīng)因此不混淆與光學(xué)變焦的安排。這是不是變體中顯示記錄的像素?cái)?shù)據(jù)，它應(yīng)該不會(huì)混淆與顯示的縮放選項(xiàng)，要么。事實(shí)上，掃描變焦是一個(gè)機(jī)械變焦控制的掃描裝置的力學(xué)性能 （盡管這是電力驅(qū)動(dòng)和控制電子和電算化）。
正對(duì)減少掃描振幅，直到它達(dá)到零沒有限制，掃描縮放可以提供無限的放大倍數(shù)。不過： 像與目鏡的放大倍數(shù)在普通顯微鏡下，有定義當(dāng)掃描縮放跨越地平線上的有意義的使用規(guī)則。這些規(guī)則取決于分辨率及放大倍數(shù)的鏡頭，并記錄每個(gè)維度的像素的數(shù)目。成像，20 倍以上的掃描縮放很少需要。較高的縮放因子僅用于激光操作，例如漂白或活化。
為不同的制造商使用不同的字段編號(hào)，掃描縮放的絕對(duì)值不是可比較的。另外混淆營辦商，一些使用縮放因素甚至比一個(gè)小。一個(gè)更合理的值將實(shí)際使用的字段數(shù)，只是通過計(jì)算掃描區(qū)域的對(duì)角線和乘以這由物鏡的放大倍數(shù)。與這一指標(biāo)，它是甚至可能比較在不同光放大倍數(shù) （不同物鏡） 的表現(xiàn)。
不掃描時(shí)全 （光學(xué)） 字段，一個(gè)人可以自由選擇字段的哪些部分進(jìn)行掃描。此函數(shù)稱為"淘金"，需要在掃描偏移量的編程，即掃描程序運(yùn)行不對(duì)稱。這只是可供閉環(huán)掃描儀。共振掃描儀需要不同的解決方案為平移。
圖 2： 頂部： 光學(xué)的視野充分利用由方形掃描，觸及中間圖像字段的限制。大小對(duì)應(yīng)于正方形的對(duì)角線 (與直徑的圓形領(lǐng)域 （虛線圓圈） 通常表明作為字段編號(hào) FN.通常情況下，最大掃描的區(qū)域是略低光場(chǎng)數(shù)相同，因此我們將調(diào)用它 FN0要與之比較放大掃描。
中東： 如果掃描振幅降低，例如由因子為 3 這兩個(gè)維度，然后使用的領(lǐng)域也是原場(chǎng)直徑的 1/3。光學(xué)分辨率仍維持不變，掃描分辨率增加，這是有效放大。此操作類似于對(duì)原始領(lǐng)域 （1 x 放大） 3 倍變焦。為適當(dāng)?shù)谋容^，這應(yīng)顯示的 FN，這里 FN = FN0/ 3。
底部： 縮放的掃描啟動(dòng)時(shí)的中點(diǎn)，掃描的區(qū)域可以移動(dòng)內(nèi)光場(chǎng)。這稱為泛函數(shù) （平移）。
如何糾正虛假的移動(dòng)
正如前面提到的在掃描時(shí)的速率限制元素是 x 振鏡。如果沒有空閑的時(shí)間，所需的追述，和掃描儀可以操作在一個(gè)完美的鋸齒波，則每個(gè)像素的時(shí)間將是 1/f * x，與正在掃描頻率 f 和 x 的像素?cái)?shù)。為真正的掃描儀，這是沒有完全達(dá)到，回縮的時(shí)間是有限的以及機(jī)械的延伸，"物鏡"被削掉，正如他們所顯示的非線性。更高的速度，可編程掃描儀操作在正弦波模式下，也可能是最慢的速度，當(dāng)然。共振掃描儀只能掃描正弦規(guī)律變化。
如果掃描正弦，然后空間-時(shí)間的關(guān)系不再是線性的。作為圖像扭曲是不可以接受，強(qiáng)度有等距的記錄 x 和 y，對(duì)應(yīng)于 inequidistant 記錄的時(shí)間。因此，數(shù)據(jù)記錄 （像素） 在一條線的開始時(shí)間是線的密度掃描儀快的線中間并且在，兩端相距越來越遠(yuǎn)，掃描速度為零在結(jié)束和開始朝著相反的方向前進(jìn)。不是完全適當(dāng)?shù)牡赡芙鉀Q這個(gè)問題將使用只有正中為正弦波，近似呈線性。但是然后一會(huì)失去 90%的可用的掃描時(shí)間，（雖然激光是的所有的時(shí)間），將需要在更大的振幅，反過來會(huì)減慢振鏡掃描器掃描。因此，一個(gè)使用一個(gè)較大的分?jǐn)?shù)，例如 80%的一列火車 （這在雙向模式中操作時(shí)，給出了一個(gè)時(shí)間周期的 60%） 和適用的非線形的像素時(shí)鐘。這個(gè)非線性像素時(shí)鐘容易獲得閉環(huán)掃描儀，因?yàn)樗鼈兲峁┝耸褂梦恢媒獯a供外部使用。非線性像素時(shí)代的第二個(gè)作用是每個(gè)像素的錄制時(shí)間也是位置相關(guān)的事實(shí)。如果一個(gè)員工強(qiáng)度電流轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)的電荷放大器，像素將會(huì)更明亮的邊緣。此外，噪音較少的邊緣與中心的掃描。對(duì)于正常成像，這不是一個(gè)問題。依賴噪聲的方法，如柵格圖像相關(guān)，會(huì)遭受這種記錄，由于噪聲也是短像素高和低的長像素為單位）。在這里，就必須確保不斷整合時(shí)代整個(gè)掃描區(qū)域 （這是最大的中心的短像素長度）。高頻率采樣和 intrapixel 積累,介紹了共焦顯微術(shù) Leica TCS SP5 允許的每個(gè)像素的位置及速度的積分時(shí)間控制。
圖 3： 左： 當(dāng)掃描正弦和錄音數(shù)據(jù)與統(tǒng)一的像素時(shí)鐘 dt，信號(hào)將會(huì)來自非等距點(diǎn)在樣本中，并因此會(huì)扭曲圖像。在中心，該圖像將會(huì)擴(kuò)大由于掃描儀的速度更快的速度 （每時(shí)間距離： dsC).在邊緣，圖像就會(huì)受到擠壓由于掃描儀的速度慢 （每時(shí)間距離： dsE).
右： 為了獲取數(shù)據(jù)在空間上等距點(diǎn) ds，像素時(shí)鐘已被編程為更長的時(shí)間的邊緣 （dtE） 和更短的時(shí)間在中心 (dtC).
一個(gè)行人的解決方案： 使用 Ronchi 光柵和砍光
A 共振掃描儀不是可編程的速度，掃描偏移和缺乏精確位置讀出。要仍雇用共振掃描儀與效益，這些缺點(diǎn)需要得到補(bǔ)償。第一個(gè)可行的解決辦法使用光學(xué)標(biāo)尺中所述采樣時(shí)鐘是 1995 年由 R.Tsien 帕的共焦手冊(cè)。這種方法利用定向到作為位置探針掃描鏡的背面 （也是反射式的） 第二，低功耗的紅色激光。反射的探測(cè)光通過光柵組成的透明和非透明條紋 (Ronchi 光柵），非常像尖樁籬柵。在光柵掃描探針光和光之后由一個(gè)光電二極管檢測(cè)到。如尖樁籬柵是等距和掃描儀運(yùn)動(dòng)正弦波，調(diào)制光探針施加正弦脈沖長度與光明黑暗模式。這些模式的側(cè)面可以用作一個(gè)像素時(shí)鐘，然后是正弦波的時(shí)間，但在掃描的場(chǎng)空間等距。
雖然這一概念解決了非線性像素時(shí)鐘，它有它的局限性。像素為單位） 的最大數(shù)目被法治的網(wǎng)格光柵中的元素?cái)?shù)。像素?cái)?shù)只可能在整個(gè)數(shù)字分?jǐn)?shù)在柵欄上的木條數(shù)目的切換。
可用縮放因素取決于適當(dāng)?shù)墓鈻牛?較高的縮放因子為同等像素?cái)?shù)字需要較短 （和密度） 光柵。因此，那里是沒有連續(xù)縮放的方式，不得不改變光柵的探針梁路徑切換時(shí)縮放，其中。因此，一套的光柵光柵在存儲(chǔ)庫中 — — 通常是一個(gè)可旋轉(zhuǎn)的圓盤必須可用。
平移不是用這種機(jī)械參考測(cè)量可用的。
圖 4： 左： 諧振的掃描共焦光學(xué)機(jī)械像素時(shí)鐘解碼的示意圖。用于成像、 激光針對(duì)通過分裂的鏡子上掃描鏡和激發(fā)熒光 （藍(lán)色跟蹤） 樣品中。所發(fā)出的光 （綠色跟蹤） 被 descanned 由掃描鏡，劈裂的鏡子所反映和轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)的探測(cè)器。輔助激光定向到掃描鏡 （紅色跟蹤） 的后側(cè) （還反映）。它通過光柵導(dǎo)致二進(jìn)制信號(hào)像素p從檢測(cè)光電二極管。
右： 提取的一整套的像素時(shí)鐘通過追蹤探測(cè)光 （反映在背側(cè)的掃描鏡，x') 結(jié)束組成的固定數(shù)量的不透明和透明的等距條紋網(wǎng)格。該傳感器將產(chǎn)生強(qiáng)度信號(hào)我p其中，然后轉(zhuǎn)換成像素觸發(fā)脈沖 t像素.
一個(gè)聰明的解決方案： 使用鎖中并提取整個(gè)運(yùn)動(dòng)
我們?nèi)绾慰梢栽O(shè)計(jì)為共振掃描儀控件允許連續(xù)縮放和任意數(shù)量的像素最多最大的選擇？與單向或雙向掃描用戶的請(qǐng)求嗎？在 2000 年由徠卡 TCS sp2 介紹了穩(wěn)定、 精確的解決方案。這一概念以來已在系統(tǒng)中與共振掃描儀從徠卡。
諧振振鏡掃描器是扭諧波振蕩器。他們?cè)诤喼C運(yùn)動(dòng)的旋轉(zhuǎn)振蕩。因此，他們的模式是運(yùn)動(dòng)的一個(gè)嚴(yán)格的正弦函數(shù)。我們需要做的一切是測(cè)量的實(shí)際相位和振幅的議案中掃描儀，并激勵(lì)信號(hào)進(jìn)行比較。測(cè)量是通過掃描鏡后方面上，閃耀的紅外二極管。要檢測(cè)信號(hào)，采用位置敏感器件 （PSD）。這是無定形和因此連續(xù)的測(cè)量設(shè)備，與不同的光柵，有大量預(yù)定義的元素 （限制測(cè)量的分辨率）。從那以后，我們可以通過鎖的方法，它允許我們創(chuàng)建一個(gè)類似于鏡子的真實(shí)運(yùn)動(dòng)的合成正弦函數(shù)提取的確切的振幅和相位。這是可能的因?yàn)槠焚|(zhì)因子 q 諧振振鏡是 1000 的范圍內(nèi)。這意味著，系統(tǒng)總是激振蕩正弦規(guī)律變化的共振頻率-偏差是小于 0.1%，即使一個(gè)方波的興奮。共振頻率取決于溫度和其他環(huán)境的參數(shù)，但當(dāng)我們測(cè)量頻率，我們可以肯定的運(yùn)行在最佳頻率掃描儀。這種方法不是靠對(duì)精度的光柵，也不調(diào)整和更換這種光柵或其他機(jī)械的或光的艾滋病問題。通過高質(zhì)量測(cè)量振幅和振蕩器的相位，我們?cè)谌魏螘r(shí)候都有鏡子的位置非常確切的知識(shí)。
現(xiàn)在，在任何時(shí)刻了解現(xiàn)場(chǎng)樣品中的位置，我們可以將檢測(cè)到的信號(hào)分配給的空間坐標(biāo)在 x 和 y （和 z）。我們可以自由地分解檢測(cè)強(qiáng)度 （其中我們連續(xù)地測(cè)量用高頻率采樣器），在任意數(shù)量的像素為單位） 的火車。那就是： 如果像素的最大數(shù)目是例如 1000 每行，我們從理論上講可以請(qǐng)求任何掃描格式 1 到 1000 之間。
此外，我們可以決定使用被測(cè)的信號(hào)對(duì)應(yīng)于 x 掃描的邊緣處的像素時(shí)間較長。或者，要確保平等的性質(zhì)來衡量高階矩像強(qiáng)度的方差的相關(guān)性研究，我們可以限制像素長度對(duì)整個(gè) x 掃描一個(gè)常數(shù)。
當(dāng)我們衡量和控制幅值，我們可以不斷改變字段大小。那就是： 連續(xù)縮放，這是不可能與機(jī)械格柵的引用。
如果我們想要移動(dòng)縮放的區(qū)域在顯微鏡的視野中，我們可以在一個(gè)可旋轉(zhuǎn)的設(shè)備，允許一個(gè)機(jī)械的偏移量加上裝載的共振掃描儀 （在這里： 在 x 方向）。位置敏感器件和提取的屬性與鎖在系統(tǒng)仍工作在這些條件，允許我們使用泛函數(shù)與共振掃描下的振蕩。
圖 5： 左： 諧振的掃描共焦與鎖在像素時(shí)鐘解碼的示意圖。用于成像、 激光通過一個(gè)可編程的光聲拆分器到掃描鏡子上定向和激發(fā)熒光樣品 （藍(lán)色跟蹤） 中。所發(fā)出的光 （綠色跟蹤） 是由掃描鏡 descanned、 由器質(zhì)性傳播和轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)的探測(cè)器。一種輔助的紅外二極管被針對(duì)掃描鏡 （紅色跟蹤） 的后側(cè) （還反映）。它到達(dá)位置敏感器件 （PSD），它提供了一個(gè)信號(hào)，表明可以重現(xiàn)完整的掃描鏡運(yùn)動(dòng)。
右： 塊圖的位置控制可調(diào)諧像素時(shí)鐘與共振掃描儀。鏡子里的運(yùn)動(dòng)是由位置敏感器件 （PSD） 進(jìn)人鎖定放大器監(jiān)察。在這里，實(shí)際運(yùn)動(dòng) （act） 的幅值和相位與勵(lì)磁信號(hào) (nom) 進(jìn)行比較。基于 DSP 控制器調(diào)整任何偏離了最佳的操作，并提供正確的參數(shù)到一個(gè)像素時(shí)鐘模塊。在這里，從顯微鏡的發(fā)射信號(hào)分為空間等距段 （像素時(shí)鐘）。每個(gè)像素的實(shí)際積分時(shí)間也是可控和可覆蓋的完整像素時(shí)間 （不同樣長的邊緣與中心），或修剪世俗地等距測(cè)量到的像素積分時(shí)間。