光學(xué)顯微鏡的分辨率被定義為上仍然可以由觀察者或攝像機(jī)系統(tǒng)作為單獨(dú)的實(shí)體來區(qū)分一個(gè)標(biāo)本兩點(diǎn)之間的*短距離。 這一重要的概念，例如，列于下面的圖（圖1），在那里光從樣本的點(diǎn)源在顯微鏡中間像平面顯示為艾里衍射圖案。

顯微鏡物鏡的分辨率極限是指其在衍射圖（圖中的說明）2緊密間隔的艾里磁盤之間進(jìn)行區(qū)分的能力。 中間像平面附近的衍射圖形的三維表示被稱為點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù) ，并且示于圖1的下部。 檢體圖像是由一系列形成艾里圖案和說明了兩個(gè)二維和三維的緊密間隔的點(diǎn)光源來表示。

分辨率在光學(xué)顯微鏡有點(diǎn)主觀的價(jià)值，因?yàn)樵诟叻糯蟊堵?，圖像可能會(huì)出現(xiàn)不清晰，但還是可以解決的物鏡的*大能力。 數(shù)值孔徑確定一個(gè)物鏡的分辨能力，但整個(gè)顯微鏡的光學(xué)系的總分辨率也取決于聚光鏡的數(shù)值孔徑時(shí)。 較高的總系統(tǒng)的數(shù)值孔徑時(shí)，分辨率越高。

顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的正確定位是非常重要的也是為了確保*大的分辨率。 臺(tái)下聚光必須匹配的物鏡相對(duì)于數(shù)值孔徑和調(diào)整光圈光闌精確光錐的形成和標(biāo)本的照明。 用于圖像的標(biāo)本的光的波長光譜也是通過顯微鏡得到的分辨率的程度的決定因素。 較短的波長是能夠解決的細(xì)節(jié)在更大程度比是較長波長的光。 有已衍生來表達(dá)的數(shù)值孔徑，波長和分辨率之間的關(guān)系數(shù)的公式：

分辨率（R）=  /（2NA）	（1）
分辨率（R）= 0.61  /NA	（2）
分辨率（R）= 1.22  /（NA（OBJ）+ NA（COND））	（3）

其中，r是分辨率（兩個(gè)對(duì)象之間的*小可分辨間距），NA是一個(gè)通用術(shù)語，在顯微鏡的數(shù)值孔徑，λ是成像波長，NA（OBJ）等于物鏡的數(shù)值孔徑，和NA（COND）的聚光鏡的數(shù)值光圈。 注意，等式（1）和（2）由乘法系數(shù)，這是0.5為公式（1）和0.61為差異方程（2）。這些方程是基于多種因素（包括各種光學(xué)物理學(xué)家的理論計(jì)算的）來核算的物鏡和聚光鏡的行為，并且不應(yīng)被認(rèn)為是任何一個(gè)一般物理定律的*值。 在某些情況下，如共焦和熒光顯微鏡，分辨率實(shí)際上可能*過置于由這三個(gè)方程中任一項(xiàng)的限制。 其它因素，如低樣品的對(duì)比度和亮度不理想可以用于較低分辨率，并且更經(jīng)常的情況是，R（大約0.25 微米的使用550納米的中間光譜的波長），以及數(shù)值孔徑的真實(shí)世界的*大值1.35到1.40未在實(shí)踐中實(shí)現(xiàn)。 下表（表1）提供了一個(gè)列表的分辨率（r）和數(shù)值孔徑（NA）的值由物鏡放大倍率和修正。

分辨率與數(shù)值孔徑由物鏡修正

物鏡類型   平場(chǎng)消色差 平場(chǎng)螢石 平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡 放大 NA 分辨率  （μm） NA 分辨率  （μm） NA 分辨率 （μm） 4X 0.10 2.75 0.13 2.12 0.20 1.375 10X 0.25 1.10 0.30 0.92 0.45 0.61 20X 0.40 0.69 0.50 0.55 0.75 0.37 40X 0.65 0.42 0.75 0.37 0.95 0.29 60X 0.75 0.37 0.85 0.32 0.95 0.29 100X 1.25 0.22 1.30 0.21 1.40 0.20 NA =數(shù)值孔徑

表1

當(dāng)在顯微鏡是在**對(duì)準(zhǔn)，并與臺(tái)下聚光適當(dāng)匹配的物鏡，那么我們可以替換為物鏡的數(shù)值孔徑為等式（1）和（2），與添加的結(jié)果是等式（3）簡(jiǎn)化為公式（2）。 要注意的一個(gè)重要的事實(shí)是，倍率沒有出現(xiàn)在任何這些方程的一個(gè)因素，因?yàn)橹挥袛?shù)值孔徑和照明光的波長確定試樣的分辨率。

正如我們所提到的（與所用的方程可以看出）的光的波長是在顯微鏡的分辨率的重要因素。較短波長產(chǎn)生較高的分辨率（對(duì)r值越低），反之亦然。 在光學(xué)顯微鏡的*大分辨率是實(shí)現(xiàn)了近紫外光，*短的有效成像波長。 近紫外光之后是藍(lán)色，然后綠色，*后紅光在解決標(biāo)本細(xì)節(jié)的能力。 在大多數(shù)情況下，顯微鏡使用所產(chǎn)生的白光通過一個(gè)鹵鎢燈泡照亮標(biāo)本。 可見光光譜集中在大約550納米，綠色光的主波長（我們的眼睛是*敏感的綠光）。 它是這樣的波長，是用來計(jì)算表1中的分辨率值。 數(shù)值孔徑值也是在這些方程中重要和更高的數(shù)值孔徑也將產(chǎn)生更高的分辨率。 光對(duì)分辨率的波長，在一個(gè)固定的數(shù)值孔徑（0.95）的效果，被列在表2中，以生產(chǎn)降低程度的分辨率的較長的波長。

分辨率與波長

波長  （nm） 分辨率 （微米） 360 0.19 400 0.21 450 .24 500 0.26 550 0.29 600 0.32 650 0.34 700 0.37

表2

顯微鏡的分辨能力的光學(xué)系統(tǒng)的*重要的特征，并影響一個(gè)特定試樣的細(xì)節(jié)來區(qū)分的能力。如上所討論的，在確定的分辨率的主要因素是物鏡的數(shù)值孔徑，但分辨率也取決于樣品的種類，照明的相干性，像差校正的程度，以及其他因素如任一中的光學(xué)系統(tǒng)的對(duì)比度增強(qiáng)的方法顯微鏡或在試樣本身。 在*后的分析中，分辨率是直接關(guān)系到顯微鏡的放大倍數(shù)有用和標(biāo)本細(xì)節(jié)的感知限度。