尼康顯微鏡，熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）顯微鏡與熒光蛋白的基本原理
在活細(xì)胞中，動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)之間的相互作用被認(rèn)為是發(fā)揮了關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以及廣泛的其他關(guān)鍵流程。 在過去，經(jīng)典的生物化學(xué)方法，闡明了這種相互作用的機(jī)制是司空見慣，但是弱的或短暫的相互作用，可能會發(fā)生細(xì)胞內(nèi)的天然環(huán)境是這些技術(shù)通常是透明的。 例如，合作一直懷疑蛋白本地化合作伙伴使用固定細(xì)胞免疫熒光顯微鏡檢查相互作用在原地 ，并已提交了大量的文獻(xiàn)報(bào)道基于這種技術(shù)的常用方法。 然而，由于在熒光顯微鏡的分辨率小于一個(gè)典型的蛋白的大小為幾百倍，共定位往往導(dǎo)致有疑問的結(jié)果。 一個(gè)很好的比喻就是熒光顯微鏡產(chǎn)量相當(dāng)于知識的信息，說有兩個(gè)學(xué)生大講堂。 它不提供所需的分辨率，以確定學(xué)生是否在同一教室或更好，但如果他們坐在相鄰辦公桌。
典型的熒光顯微技術(shù)，依靠由一個(gè)波長（激發(fā)），然后由后續(xù)的二次熒光發(fā)射波長較長的光的熒光基團(tuán)的吸收。 由幾十到幾百納米的激發(fā)和發(fā)射波長往往是彼此分開的。 與特定的熒光基團(tuán)標(biāo)記的細(xì)胞成分，如細(xì)胞核，線粒體，細(xì)胞骨架，高爾基體，膜，使它們定位于固定和生活制劑。 同時(shí)通過標(biāo)簽的一些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分隔的激發(fā)和發(fā)射光譜，專業(yè)熒光濾光片組合的單個(gè)熒光基團(tuán)，可以被用來在一個(gè)單一的細(xì)胞或組織切片檢查標(biāo)記的分子接近。 使用這種技術(shù)，比光學(xué)分辨率極限是緊密聯(lián)系起來的分子似乎是重合（，說共定位 ）。 這種明顯的空間接近，分子締合是可能的。 然而，在大多數(shù)情況下，生物分子之間的相互作用，以確定是否發(fā)生正常的衍射極限的熒光顯微鏡的分辨率是不夠的。
共定位測量，在*好的情況是暗示誤導(dǎo)在*壞的情況下，特別是考慮到，許多信號傳導(dǎo)通路，使用相同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，例如，網(wǎng)格蛋白包被的凹坑是利用許多受體復(fù)合物內(nèi)在化。 兩個(gè)分子或蛋白質(zhì)的知識，其實(shí)是相鄰的，并不僅僅是居住在同一街區(qū)，提供了更可靠的確定其潛在的相互作用。 歷史悠久的電子顯微鏡技術(shù)有足夠的分辨率，以滿足高精度定位，精確的標(biāo)示方法，只是缺乏必要產(chǎn)生可靠的結(jié)果。 此外，許多的合作定位技術(shù)一般應(yīng)用于使用固定的細(xì)胞內(nèi)，這就排除了非常可取的動(dòng)態(tài)測量檢測活細(xì)胞達(dá)到。 多色的熒光蛋白的熒光成像容易地允許與活細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，這是必要的瞬時(shí)相互作用的檢測，但該方法受到限制到約200納米的具有相對較差的空間分辨率。
申請的福斯特（或熒光）共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的顯微技術(shù)測定蛋白質(zhì)分子的空間接近的限制是可以克服的。 發(fā)生FRET之間的正確定位的熒光基團(tuán)，只有當(dāng)它們分開的距離是8到10納米或更小。 因此，熒光共振能量轉(zhuǎn)移是非常適合于定位在幾納米彼此的兩個(gè)分子之間所發(fā)生的蛋白質(zhì)相互作用的調(diào)查。 在過去的十年里，F(xiàn)RET方法已經(jīng)得到普及，由于在應(yīng)用中需要使用的特定蛋白質(zhì)和多肽融合綠色熒光蛋白（GFP）及其突變衍生物基因靶向的崛起。 兩個(gè)光譜上不同的熒光蛋白（稱為FP-FRET）之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移已被廣泛地應(yīng)用于兩個(gè)明顯分開的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如下面所討論。 圖1給出的是一個(gè)雅布隆斯基參與之間的供體發(fā)射和受體吸收FRET耦合激發(fā)態(tài)躍遷能量圖。 吸收和發(fā)射的轉(zhuǎn)換表示的直線的垂直箭頭（藍(lán)色，綠色和紅色），而波浪形的黃色箭頭指示的振動(dòng)弛豫。 雅布隆斯基圖表明其正確位置，他們應(yīng)該出現(xiàn)從光子介導(dǎo)的電子躍遷的虛線繪制的耦合轉(zhuǎn)換。 在一個(gè)合適的接受體的存在下，供體熒光團(tuán)激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移受體直接而發(fā)射一個(gè)光子（紫羅蘭色的圖1中箭頭所示）。 將所得的熒光敏化發(fā)射具有受體的發(fā)射光譜的特征相似。
廣泛實(shí)施的主要障礙之一FRET技術(shù)在活細(xì)胞中的調(diào)查一直缺乏合適的方法，用適當(dāng)熒光標(biāo)記特定的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。 *近開發(fā)的熒光蛋白，具有廣泛的光譜和日益復(fù)雜的蛋白嵌合體（融合以及生物傳感器）已經(jīng)導(dǎo)致了一些潛在的熒光蛋白對，是非常有用的FRET實(shí)驗(yàn)。 FRET熒光蛋白的應(yīng)用涉及到兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)，每個(gè)不同的熒光蛋白融合將選定的一成生物傳感器（一個(gè)單一的基因編碼的結(jié)構(gòu)）或間進(jìn)行測量。 后一種方法已被用于圖像的各種蛋白質(zhì)的相互作用，包括受體的寡聚化和闡明轉(zhuǎn)錄因子的功能。 然而，進(jìn)行FRET檢測的獨(dú)立蛋白嵌合體是困難得多，由于可變化學(xué)計(jì)量時(shí)，不可避免地發(fā)生在活細(xì)胞中表達(dá)獨(dú)立的熒光實(shí)體。 不管難度，這種性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)可以得到信息的結(jié)果，當(dāng)安裝了適當(dāng)?shù)目刂?，并以?yán)格的精度進(jìn)行調(diào)查。
熒光蛋白質(zhì)傳感器
熒光蛋白的生物傳感器已廣泛的實(shí)用匯報(bào)多樣化的胞內(nèi)過程。 通過創(chuàng)造性地融合對執(zhí)行關(guān)鍵功能，涉及各方面的生理信號的生物聚合物的熒光蛋白，研究的科學(xué)家已經(jīng)開發(fā)出了一系列新的分子探針，可用于光學(xué)活細(xì)胞成像的重要過程，如鈣波感應(yīng)，循環(huán)核苷酸信使作用，pH值的變化，膜電位的波動(dòng)，磷酸化和細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶行動(dòng)。 另一種方法，但非常有用的，戰(zhàn)略生物傳感器建設(shè)涉及熒光蛋白骨架結(jié)構(gòu)本身的修改，要么肽分割成個(gè)別單位相結(jié)合， 在體內(nèi)產(chǎn)生熒光（一種技術(shù)被稱為雙分子熒光互補(bǔ);BiFC ）或加入天然的氨基和羧基末端，并創(chuàng)建一個(gè)插入位點(diǎn)的分子內(nèi)傳感器肽。
*熒光蛋白質(zhì)的生物傳感器是一個(gè)鈣離子指 示劑卡 默萊昂 ，夾著蛋白鈣調(diào)素和鈣的鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肌球蛋白輕鏈激酶（M13域）之間的增強(qiáng)的藍(lán)色和綠色熒光蛋白（EBFP和EGFP）構(gòu)成。 在水平的不斷提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子的存在下，M13域結(jié)合的鈣調(diào)蛋白的肽，以產(chǎn)生增加的熒光蛋白之間的FRET。 不幸的是，該傳感器由一個(gè)非常低的動(dòng)態(tài)范圍（熒光增加了1.6倍）阻礙，很難想象，由于缺乏亮度和耐光性較差EBFP。 YFP的衍生物（稱為camgaroos）生成的鈣敏感的肽插入在開始的第七β時(shí)，使用相同的模板，將青色和黃色的變種ECFP和EYFP，得到較高的信號電平，和甚至更好的結(jié)果，得到的改進(jìn)的版本鏈熒光蛋白骨干。 位于這種不尋常位置傳感器肽是相當(dāng)良好的耐受性方面保持高水平熒光。 然而，另一種策略利用**的桶結(jié)構(gòu)常見的熒光蛋白重新配置的蛋白質(zhì)的端部連接的天然N末端和 C末端，并創(chuàng)建一個(gè)新的起始密碼子的結(jié)構(gòu)的中央?yún)^(qū)域內(nèi)（通常在幾個(gè)位置之一了循環(huán)）。 稱為循環(huán)置換熒光蛋白，這些結(jié)構(gòu)修飾衍生物可以稠合鈣調(diào)蛋白和M13，產(chǎn)生極好的鈣的生物傳感器。
緊接著遺傳指標(biāo)，pH值，磷酸化，和蛋白酶活性鈣的生物傳感器。 一般有兩種方法可用于以適應(yīng)熒光蛋白的pH值的傳感器。 首先依賴于綠色熒光蛋白的熒光靈敏度（的pKa = 5.9）和EYFP（pKa值= 6.5）結(jié)合的其它蛋白質(zhì)的相對不敏感性，如ECFP（pKa值= 4.7）或紅色熒光蛋白 （的pKa = 4.5）的酸性環(huán)境。 與較不敏感的熒光蛋白EGFP或EYFP融合建立一個(gè)比例的探頭，可用于測量細(xì)胞內(nèi)的酸度。 第二種方法依賴于質(zhì)子改變原生（野生型）的GFP導(dǎo)致雙峰式頻譜公司的天然蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)變。 A類的探針命名的pHluorins，來自wtGFP，具有激發(fā)峰值從470到410納米的pH值下降的轉(zhuǎn)變。 雙排放pH傳感器也得到了發(fā)展，在綠色和藍(lán)色光譜區(qū)域有峰。 雖然無法實(shí)時(shí)報(bào)告激酶活性，磷酸化的生物傳感器包括含有從一個(gè)特定的激酶和一個(gè)之間夾持兩個(gè)FRET能力的熒光蛋白的磷酸化肽的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的磷酸化基序的肽。 由激酶磷酸化的生物傳感器，磷酸肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域的磷酸化的序列結(jié)合，從而調(diào)用或破壞FRET。 這個(gè)簡單的策略已經(jīng)被證明產(chǎn)生**和高度特異性的生物傳感器。 與許多其它生物傳感器的主要缺點(diǎn)是降低了動(dòng)態(tài)范圍。
也許*廣泛使用的生物傳感器的設(shè)計(jì)，篩選新的或改進(jìn)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，對涉及到的蛋白酶裂解位吸附試驗(yàn)（參見圖2）。 簡單的圖案由兩個(gè)聯(lián)系在一起的，其中包含一個(gè)共識的蛋白酶裂解位點(diǎn)的短肽熒光蛋白。 在一般情況下，該傳感器具有非常強(qiáng)的能量轉(zhuǎn)移裂解接頭序列后，完全取消。 由于該技術(shù)通常具有高動(dòng)態(tài)范圍的水平，它可以被用于篩選新的青色和綠色熒光共振能量轉(zhuǎn)移的供體與黃色，橙色和紅色的受體。 *大的家族蛋白酶的生物傳感器，采用了敏感的裂解位點(diǎn)的半胱天冬酶家族的蛋白酶，使傳感器可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中檢查。 在過去的數(shù)年中，大量的新穎的生物傳感器，同時(shí)使用敏化熒光蛋白和熒光共振能量轉(zhuǎn)移對已有報(bào)道。盡管繼續(xù)FRET傳感器采用ECFP和EYFP衍生物的動(dòng)態(tài)范圍的限制，這一策略已被廣泛采用，這可能是由于簡單的比例測量探頭建設(shè)，緩解。 新戰(zhàn)略將毫無疑問出現(xiàn)使用更*的服務(wù)，以增加這個(gè)非常有用的一類探頭的動(dòng)態(tài)范圍等性能的熒光蛋白組合。
FRET基本原理
捐助熒光FRET涉及電子激發(fā)態(tài)中，這可能會激發(fā)能量轉(zhuǎn)移到附近的受體熒光（或發(fā)色團(tuán)）在非輻射的方式，通過遠(yuǎn)程偶極 - 偶極相互作用的基本機(jī)制。 的理論支持的能量轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)的治療激發(fā)熒光團(tuán)的振蕩偶極子與第二偶極子具有相似的諧振頻率，可以進(jìn)行能量交換的概念。 在這方面，共振能量轉(zhuǎn)移是類似于耦合振子的行為，如在相同的頻率或無線電天線的一對音叉振動(dòng)。 與此相反，輻射能量轉(zhuǎn)移需要發(fā)射和重新吸收光子，并依賴于試樣的物理尺寸和光學(xué)性質(zhì)的，以及容器的幾何形狀的波陣面途徑。 共振能量轉(zhuǎn)移和輻射機(jī)制不同，可以產(chǎn)生顯著量的結(jié)構(gòu)信息有關(guān)的供體 - 受體對。
周邊溶劑殼熒光團(tuán)共振能量轉(zhuǎn)移是不敏感的，因而產(chǎn)生*的溶劑相關(guān)的事件，如熒光猝滅，激發(fā)態(tài)反應(yīng)，溶劑松弛，或各向異性的測量揭示的分子信息。 參與共振能量轉(zhuǎn)移的熒光團(tuán)的主要溶劑的影響是供體和受體的光譜特性的影響。 在更長的距離比短距離的溶劑效應(yīng)和介電性質(zhì)的成分（溶劑和主機(jī)大分子）的位置所涉及的熒光團(tuán)之間的無輻射能量轉(zhuǎn)移發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移的功效上具有非常小的影響，這主要取決于供體和受體熒光基團(tuán)之間的距離。
熒光共振能量轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象還沒有介導(dǎo)的光子發(fā)射，并且，甚至不要求受體生色團(tuán)是熒光。 然而，在大多數(shù)應(yīng)用中，供體和受體熒光能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生通過供體熒光淬滅的熒光壽命的減少，也伴隨著受體的熒光發(fā)射的增加體現(xiàn)。 特奧多爾·福斯特共振能量轉(zhuǎn)移的理論*初是開發(fā)，以紀(jì)念他的貢獻(xiàn)，*近被他的名字命名。 福斯特理論表明，熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率（E）的兩個(gè)分子之間的距離（用r表示）的倒數(shù)第六功率變化：
EFRET = 1/[1 + (r/R0)6]
其中，R（0）為特征的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率為50％，這可以計(jì)算出任何對這個(gè)變量也被稱為福斯特半徑，并在下面更詳細(xì)地討論）的熒光分子（距離。 熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的理論熒光基團(tuán)對（增強(qiáng)型青色和黃色熒光蛋白）以圖形方式顯示在圖3（a）。 由于逆第六電源依賴于兩分子之間的相關(guān)（r）的距離，該曲線具有一個(gè)非常急劇下降。 距離小于R（0），熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率接近*大，而距離大于R（0），效率迅速趨近于零。 有用的范圍，用于測量FRET的紅色與0.5和1.5×R（0）的限制，在圖3（a）中的陰影區(qū)域所示。 FRET技術(shù)可以有效地使用這些距離接近R(0)作為分子的統(tǒng)治者 ，而事實(shí)上FRET已被改編為結(jié)構(gòu)生物學(xué)等用途的通過精密光譜方法。 然而，對于大多數(shù)應(yīng)用中在細(xì)胞生物學(xué)中，可用的信號 - 噪聲比限制FRET實(shí)驗(yàn)更二進(jìn)制讀出。 作用時(shí)，一個(gè)測量往往會只能夠區(qū)分FRET高和低-FRET，或簡單地之間的FRET的存在和缺乏。
正如前面所討論的，R(0)，可以容易地計(jì)算出任何對熒光分子。 R（0）的值在水性溶液（或緩沖）由一個(gè)相當(dāng)簡單的方程與完善的輸入?yún)?shù)：
R0 = [2.8 x 1017 × Κ2 × QD × ΕA × J(λ)]1/6 nanometers
Κ(2)或卡伯平方的兩個(gè)熒光團(tuán)之間的偶極子（參見圖3（b）就用于計(jì)算取向因子的角度概要）表示的取向因子，Q(D) 是供體的量子產(chǎn)率，Ε(A)是*大的受體在每厘米相互摩爾消光系數(shù)，和J(λ)是光譜的重疊積分（參見圖4）,F(D)(λ)之間的歸一化供體熒光，激發(fā)光譜和受體，E(A)(λ) ，根據(jù)公式：
J(λ) = FD(λ) × ΕA(λ) × λ4dλ
雖然可能會出現(xiàn)復(fù)雜的數(shù)學(xué)，大多數(shù)參數(shù)是常數(shù)，在文獻(xiàn)中很容易被發(fā)現(xiàn)。 的兩個(gè)*重要的方面，通常需要進(jìn)一步的解釋Κ（2）和J（λ），重疊積分。 取向角變量（Κ（2））只是表示該FRET耦合取決于兩個(gè)熒光團(tuán)之間的角度大致相同的方式的無線天線的位置可能會影響其接收。 如果供體和受體的相互平行地排列，F(xiàn)RET的效率會更高比，如果他們是面向垂直。 這種程度的對應(yīng)定義Κ（2）。 雖然Κ（2）可以在0和4之間會發(fā)生變化，它通常是假定為2/3，這是集成了所有可能的角度的平均值。 對于幾乎任何現(xiàn)實(shí)的情況κ（2）接近2/3，而且通常研究者可以做調(diào)整這個(gè)值無關(guān)（雖然有些生硬地把他們的目標(biāo)蛋白質(zhì)的利益附加熒光蛋白質(zhì)，這可能導(dǎo)致戲劇性效果）。 重疊積分，J（λ）時(shí) ，是兩光譜之間的重疊區(qū)域，如在圖4中示出。的其他參數(shù)，可能會影響FRET的供體和受體的消光系數(shù)的量子產(chǎn)率。 因此，為了*大限度地提高FRET信號，研究者必須選擇量子產(chǎn)率*高的供體，*高吸收的受體，熒光基團(tuán)，具有顯著的重疊，在它們的光譜公司。 這一理論被反復(fù)通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，有沒有其他機(jī)制，以*大限度地提高非對齊的熒光探針的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。
應(yīng)當(dāng)指出，上面所討論的每一個(gè)參數(shù)的影響僅由第六電源福斯特半徑計(jì)算。 因此，增加一倍的供體的量子產(chǎn)率只有12.5％的R（0）的變化結(jié)果。 因?yàn)閹缀跛袩晒釬RET成像實(shí)驗(yàn)具有很高的量子產(chǎn)率（大于0.5）和消光系數(shù)（大于50,000），可能福斯特半徑值的范圍是有限的4至6納米，和大多數(shù)FRET對的平均值R（0）?5納米。 由于FRET效率強(qiáng)烈地依賴于分離以及FRET對的熒光基團(tuán)的相對方向的距離，熒光共振能量轉(zhuǎn)移，可以用來檢測蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用而產(chǎn)生的變化，這兩種蛋白之間的親和力或變動(dòng)的變動(dòng)他們的結(jié)合的構(gòu)象。 這是值得重復(fù)的是，對于大多數(shù)FRET成像在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)一般區(qū)分只有兩種狀態(tài)之間（FRET沒有FRET）和附加信息是必要的助手解釋所觀察到的，在分子FRET變化。
FRET測量影響因素
在實(shí)踐中，廣泛的問題可以復(fù)雜和/或妥協(xié)FRET測量，*終導(dǎo)致含糊或無意義的結(jié)果。 其中的主要問題是成像時(shí)，供體和受體熒光基團(tuán)，可能會表現(xiàn)出明顯不同的亮度級別。 雖然從理論上說，這種差異不應(yīng)該是一個(gè)問題，但是在實(shí)踐中，因?yàn)榇蠖鄶?shù)儀器可以測量只有有限的動(dòng)態(tài)范圍，雙熒光成像可能會導(dǎo)致飽和（對于較亮的熒光基團(tuán)），而另一個(gè)通道主要是由系統(tǒng)的一個(gè)通道噪音調(diào)光熒光。 因此，只要有可能，*好使用一個(gè)供體和受體，可比亮度。
另一個(gè)因素，可以限制檢測FRET的供體 - 受體的化學(xué)計(jì)量，是在10:1和1:10之間的范圍之外。 這個(gè)因素可能是一個(gè)嚴(yán)重的限制FRET測量蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用，其中一個(gè)合作伙伴可能是多余濃度。 主要問題是不接受FRET熒光標(biāo)記的背景FRET小級別的測量。 由于這樣的事實(shí)，實(shí)在沒有什么可以做，以改善這種情況，主機(jī)蛋白質(zhì)相互作用可能落入這一類的實(shí)驗(yàn)是根本不適合考試FRET技術(shù)。 對于如上所述，只有一個(gè)單一的供體和受體的構(gòu)造的熒光蛋白質(zhì)的生物傳感器，化學(xué)計(jì)量比是固定的，保證為1:1，因此，此問題不會出現(xiàn)的信號電平保持恒定，無論濃度的生物傳感器。
在場的流血通過（也稱為串?dāng)_和交叉 ）和頻譜重疊熒光團(tuán)之間的交叉激勵(lì)也很重要的問題，可以阻礙FRET調(diào)查（參見圖5）。 在某些情況下，受體可以直接與選擇的波長區(qū)域中的光激發(fā)，以激發(fā)供體（圖5（a））。 此外，從供體的熒光泄漏到受體熒光的檢測通道，尤其是當(dāng)供體和受體的發(fā)射光譜公司表現(xiàn)出顯著的重疊（圖5（b））。 因?yàn)檫@兩個(gè)來源的串?dāng)_產(chǎn)生的有機(jī)熒光的光物理必定是目前任何FRET對，他們必須解決的時(shí)候FRET測量。 選擇是很好的分離光譜的熒光團(tuán)，是一個(gè)很好的機(jī)制，以減少串?dāng)_。 然而，在大多數(shù)情況下的光譜分離的增加也減少了重疊積分（J（λ）），這在實(shí)踐中通常被轉(zhuǎn)化為能力下降，檢測到FRET信號。
*后，兩個(gè)熒光基團(tuán)，如果沒有正確對齊的信號可以被減少（例如，具有Κ（2）的值近似為零），或當(dāng)它們存在根本就沒有定位在福斯特半徑（大于6納米水平的FRET ）。 作為一個(gè)例子，如果兩個(gè)標(biāo)記的蛋白質(zhì)相互作用，但位于配合物的相對側(cè)上的熒光標(biāo)記，則有可能無法檢測到FRET信號，即使感興趣的蛋白質(zhì)綁定。 在一般實(shí)踐中，這種類型的假陰性是相當(dāng)普遍的，特別是與熒光蛋白的熒光共振能量轉(zhuǎn)移貿(mào)易伙伴。 通常情況下，一些標(biāo)記策略之前，需要有足夠和可靠的FRET信號被檢測到。 然而，上述問題可以得到緩解（或部分）的矢量結(jié)構(gòu)或進(jìn)行合成標(biāo)記實(shí)驗(yàn)之前使用的熒光對明智的選擇。
如圖5所示的重疊中的激發(fā)和發(fā)射光譜ECFP和mVenus的，目前*優(yōu)選的熒光蛋白對FRET調(diào)查。 激發(fā)（圖5（a））和發(fā)射光譜（圖5（b）），這兩種蛋白質(zhì)表現(xiàn)出相當(dāng)大的重疊。 直接激發(fā)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移受體（mVenus;紅色曲線）可以是顯著的波長取決于用于激發(fā)的供體（ECFP;青色曲線或mCerulean的藍(lán)色曲線），由于較高的消光系數(shù)黃色蛋白相比，青色蛋白。 這種重疊是特別成問題的ECFP的作為給體使用時(shí)，可以部分抵消了具有高消光系數(shù)，如mCerulean使用CFP的變種。 請注意，在圖5（a）中的勵(lì)磁曲線按比例繪制的，以反映黃色和青色蛋白之間的消光系數(shù)的差異。 激發(fā)波長為458納米，產(chǎn)生一個(gè)更高的水平的mVenus激發(fā)串?dāng)_比激發(fā)波長為405納米或440納米。 ECFP廣泛的熒光發(fā)射光譜（圖5（b）條）顯示出相當(dāng)大的強(qiáng)度重疊，整個(gè)區(qū)域發(fā)射mVenus。
FRET技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)應(yīng)用
調(diào)查采用熒光蛋白的生物傳感器，或試圖匹配的化學(xué)計(jì)量融合熒光探針分離相互作用的目標(biāo)，應(yīng)使用盡可能多的不同F(xiàn)RET分析技術(shù)可行的建立對于一個(gè)給定的實(shí)驗(yàn)方法。 這種努力是必要的，因?yàn)槊總€(gè)熒光蛋白FRET對具有不同的病理，其使用的復(fù)雜性，需要清楚地了解應(yīng)用光學(xué)顯微鏡參數(shù)測量相對較小的信號差異在大多數(shù)FRET檢測。 一旦系統(tǒng)和可能的結(jié)果是確定無疑的，則*簡單的辦法可以用于正在進(jìn)行的程序。 列表中的技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到圖像FRET是相當(dāng)廣泛的。 在一般情況下，所有現(xiàn)有的測量策略可應(yīng)用于FRET熒光蛋白實(shí)驗(yàn)，但基于現(xiàn)實(shí)的考量，一般的方法已被證明特別有用：
敏排放 -雙通道成像使用一種算法，糾正串?dāng)_激發(fā)和發(fā)射
受體漂白 -也被稱為施主去猝滅受體光漂白時(shí)，這種技術(shù)措施增加了供體發(fā)射
熒光壽命成像顯微鏡（FLIM） -熒光蛋白（或其他熒光）體壽命測量的變化
光譜成像 -令人興奮的一個(gè)或兩個(gè)波長，測量供體和受體的完整光譜剖面
熒光偏振成像 -測量偏振平行和垂直于激發(fā)高信號噪聲
每個(gè)FRET以上列出的方法都有長處和短處。 例如，在一方面中，兩個(gè)通道成像法是*簡單，但需要*復(fù)雜的控件集。 另一方面，F(xiàn)LIM的可以得到明確的測量FRET效率，但是昂貴的，尚未廣泛地提供給大多數(shù)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室儀器儀表來測量納秒壽命。
敏發(fā)射
通常也被稱為二色比與對照成像 ，敏化發(fā)射可能是*簡單的成像方法，熒光共振能量轉(zhuǎn)移。的供體熒光團(tuán)的激發(fā)的特定波長（在寬視場或共聚焦顯微鏡），收集的信號被通過使用選擇供體熒光和受體熒光的發(fā)射濾光片。 的兩個(gè)熒光團(tuán)的激發(fā)波長和熒光之間的串?dāng)_（不現(xiàn)實(shí)）不存在，那么敏化發(fā)射將是一個(gè)**的方法。 然而，熒光蛋白之間的串?dāng)_是一個(gè)重大的問題，通常需要廣泛的控制實(shí)驗(yàn)建立的FRET的存在或不存在。 因此，它是很難獲得定量準(zhǔn)確FRET使用這種方法的數(shù)據(jù)。 敏化發(fā)射是相對簡單的配置上的寬視場熒光顯微鏡下，可以在許多實(shí)驗(yàn)室中，但必要的對照實(shí)驗(yàn)，需要相當(dāng)大的圖像處理減去串?dāng)_分量，這顯著增加噪音水平測量中的不確定性。
糾正的辦法已經(jīng)制定各種致敏發(fā)射FRET成像。 的基本概念涉及多個(gè)樣品，含有：供體，只受體，和推定的FRET的供體和受體的樣品使用不同的過濾器組合。 從這些樣本的排放值允許研究者量來確定預(yù)期串?dāng)_的激發(fā)和發(fā)射通道和減去它FRET測量。 在理論上，這種方法效果很好，但不幸的是，圖像處理的要求增加噪音水平在所有的圖像。 因此，如果FRET信號分鐘，那么它可能是難以測量的FRET使用這種方法。
盡管存在上述困難，F(xiàn)RET信號是由于大的能力，同時(shí)獲得兩個(gè)圖像進(jìn)行快速動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，致敏發(fā)射測量可以是有用的。 研究FRET的動(dòng)態(tài)范圍大，以1:1的比例是固定的供體和受體的化學(xué)計(jì)量的熒光蛋白的生物傳感器時(shí)，敏化發(fā)射是一個(gè)特別有吸引力的技術(shù)。 一個(gè)很好的例子是的蛋白酶生物傳感器，如圖2所示。 這種嵌合體已設(shè)計(jì)有很高的FRET效率下降基本上為零時(shí)酶解肽連接。 其結(jié)果是一個(gè)大和容易測量的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，演示了在一個(gè)給定的時(shí)間和區(qū)域的特定的蛋白酶活性，在活細(xì)胞內(nèi)的變化。
受體漂白
雖然只限于一個(gè)單一的測量，受體漂白（或捐助去猝滅）是一個(gè)簡單的技術(shù)，往往效果極佳。基本概念利用捐助者的熒光淬滅FRET期間，因?yàn)橐恍┚柚鸁晒饽芰枯斔偷绞荏w的事實(shí)。 受體熒光光漂白的不可逆消除淬火效果，并增加了供體的熒光水平。 FRET熒光團(tuán)之間發(fā)生，捐助熒光受體被刪除時(shí)，必須增加。 在一般情況下，重要的是要確保該受體光漂白不會降低供體熒光，至其初始值的大約10％的光漂白受體。 容易滿足這些約束同時(shí)用激光掃描共聚焦顯微鏡，但也可以實(shí)現(xiàn)與寬視場或旋轉(zhuǎn)盤顯微鏡配備一個(gè)專門的照明系統(tǒng)的。
受體漂白技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是非常簡單的，定量的，只用一個(gè)單一的樣本進(jìn)行。 減去漂白后其強(qiáng)度受體在受體的存在下從供體強(qiáng)度，然后漂白后的供體強(qiáng)度的歸一化該值，可以計(jì)算出的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率。 的主要缺點(diǎn)是，受體光漂白是破壞性的，可以只使用一次，限制了它的應(yīng)用程序，這些實(shí)驗(yàn)中不涉及與動(dòng)態(tài)測量每個(gè)單元格。 此外，光漂白是一個(gè)相對緩慢的過程，通常需要幾分鐘或更長時(shí)間。 然而，它幾乎總是值得執(zhí)行受體漂白測量的實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，無論取的方法被用于測定熒光共振能量轉(zhuǎn)移。
圖6中的例子致敏排放和受體漂白FRET實(shí)驗(yàn)用活細(xì)胞成像。 圖6（a）示出一個(gè)人宮頸癌癌上皮細(xì)胞（HeLa細(xì)胞線）表達(dá)一個(gè)卡默萊昂生物傳感器包括具有介于其間的鈣敏感的肽，含有鈣調(diào)素和M13域（如上所述）熔合在一起的mCerulean mVenus的。 之前，除了鈣誘導(dǎo)劑（離子霉素），激發(fā)細(xì)胞與440納米照明產(chǎn)生青色熒光指示缺乏青色和黃色熒光蛋白（圖圖6（a））之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。 添加伊屋諾霉素，縮時(shí)后記錄兩色比成像（致敏發(fā)射）穿過細(xì)胞質(zhì)中的鈣波的生物傳感器響應(yīng)增加的電平之間的熒光蛋白的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（圖6（b）和圖6（c） FRET pseudocolored黃色，紅色）。 的非洲綠猴腎細(xì)胞（COS-7行），如圖圖6（d） - （f）項(xiàng)標(biāo)記的合成花青染料Cy3標(biāo)記（圖6（2），綠色）和Cy5（圖6（五）;紅），霍亂毒素B亞單位結(jié)合，并定位在質(zhì)膜。 于膜中，接近的兩種染料的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生一個(gè)高的水平。 漂白Cy5的細(xì)胞的選定區(qū)域（白色方塊圖第6（e））中，增加了供體去猝滅（在圖6（f）條的綠色熒光增加）時(shí)，在相應(yīng)的區(qū)域可視熒光供體通道。
熒光壽命成像顯微術(shù)（FLIM）
壽命測量是**為止*嚴(yán)格的方法，用于確定熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此外，它們也不易出現(xiàn)到串?dāng)_工件由于這樣的事實(shí)，只有供體熒光監(jiān)測。 所有熒光分子具有一個(gè)指數(shù)衰減，在納秒時(shí)間刻度上的熒光，并消減率是敏感的熒光猝滅的環(huán)境變量。 因此，F(xiàn)LIM的基本概念有點(diǎn)關(guān)系受體光漂白。 該供體的熒光被淬滅的熒光共振能量轉(zhuǎn)移相互作用，淬火的量可以通過測量存在FRET的供體熒光衰減時(shí)間的減少來確定。 以這種方式，F(xiàn)LIM的FRET效率提供了一個(gè)確定的值。 其中合并FLIM-FRET的測量的優(yōu)點(diǎn)是不敏感受體激發(fā)工件定向，以及事實(shí)上可以被耦合到熒光供體的受體本身不是熒光。 這兩方面都有助于擴(kuò)大一些有用的熒光蛋白FRET對調(diào)查。
FLIM有諸多限制，防止它主要的方式FRET成像。 主要是復(fù)雜的，在納秒壽命區(qū)的測量和檢測儀器是昂貴的取得和保持。 此外，這種類型的精密的設(shè)備沒有得到廣泛的使用。 此外，F(xiàn)LIM通常是在較慢的成像方法，可能需要幾分鐘的時(shí)間，獲取每一個(gè)形象，這限制了它在許多實(shí)用FRET實(shí)驗(yàn)。 解除這些限制可能會在未來更加人性化和更快的交鑰匙商業(yè)系統(tǒng)的開發(fā)廠家。 另一個(gè)顯著的缺點(diǎn)是，在活細(xì)胞中的熒光蛋白的壽命往往顯示多指數(shù)衰減，需要更全面的數(shù)據(jù)分析進(jìn)行定量FRET檢測。 此外，本地化的環(huán)境因素，如自體熒光，或改變pH值，也可以測得的熒光壽命縮短，導(dǎo)致工件。 因此，必須采取極為謹(jǐn)慎的解釋活細(xì)胞FLIM-FRET數(shù)據(jù)。
光譜成像
光譜成像技術(shù)是致敏發(fā)射變化FRET檢測方法，但被收集后，而不是采集數(shù)據(jù)，通過兩個(gè)獨(dú)立的通道，整個(gè)發(fā)射光譜同時(shí)含有供體和受體熒光激發(fā)捐助。 錄制整個(gè)頻譜是一個(gè)典型的用于光譜實(shí)驗(yàn)的方法，但是是一個(gè)相對較新的工具調(diào)色板除了在廣角和共聚焦顯微鏡。 的概念中心的前提下，使收集的整個(gè)熒光光譜重疊光譜分離不只是使用的發(fā)射峰，但不同的形狀的譜尾。 在收集從供體和受體熒光團(tuán)的頻譜，它是可能的，以確定供體和受體熒光的相對水平。
光譜成像技術(shù)需要專門的設(shè)備，但*的系統(tǒng)都是現(xiàn)成的許多商業(yè)共聚焦顯微鏡，可以添加到常規(guī)熒光顯微鏡以溫和的代價(jià)。 由于受體的直接激發(fā)，或在共聚焦顯微鏡中使用的激發(fā)波長的串?dāng)_水平進(jìn)行了定量分析，允許FRET的量的準(zhǔn)確測定。 這種方法的主要缺點(diǎn)是減少與獲得完整的頻譜，而不是通過兩個(gè)通道與一個(gè)過濾器為基礎(chǔ)的系統(tǒng)中收集相關(guān)的信號對噪聲比。 然而，隨著越來越多的商業(yè)系統(tǒng)中，正在開發(fā)和安裝的應(yīng)用光譜成像在熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測增加。 在不久的將來，它是光譜成像很可能會成為執(zhí)行的主要方法之一FRET成像實(shí)驗(yàn)。
圖7所示的（a）中的變化捐助終身衰減（mCerulean熒光蛋白）組成的10氨基酸接頭融合在一起的mCerulean mVenus熒光蛋白偽FRET生物傳感器。 藍(lán)色衰減曲線觀察細(xì)胞表達(dá)mCerulean單獨(dú)的一生，而紅色衰減曲線呈現(xiàn)mCerulean的的一生時(shí)獲得細(xì)胞表達(dá)的級聯(lián)蛋白。 注意蛋白參與共振能量轉(zhuǎn)移時(shí)的在壽命mCerulean減少。 曲線之間的區(qū)域表示通過FRET從mCerulean（供體）mVenus（受體）在FRET配對轉(zhuǎn)移的能量。 從450到650的納米mCerulean mVenus活細(xì)胞在405納米的激發(fā)時(shí)，在相同的偽生物傳感器的發(fā)射曲線由圖7（b）中紅色曲線描繪。 轉(zhuǎn)移的能量從mCerulean到的主要發(fā)射峰（的mVenus*大發(fā)射529納米），具有非常低的值（約25％），在475納米，峰值發(fā)射波長為mCerulean mVenus結(jié)果。 用514納米的激光漂白后mVenus的和重復(fù)的光譜掃描，發(fā)射配置文件轉(zhuǎn)移到更低的波長和非常相似的頻譜mCerulean沒有一個(gè)FRET伙伴。 在475和529納米的光譜強(qiáng)度的差異有關(guān)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率之間的耦合的蛋白質(zhì)。
極化各向異性成像
熒光偏振測量提供**的優(yōu)勢為高對比度歧視熒光蛋白FRET。 這個(gè)概念是基于這樣的事實(shí)，與偏振光的激發(fā)的熒光分子的吸收載體平行排列的激發(fā)光的偏振矢量選擇人口。 激發(fā)后，立即將保持偏振平行的熒光發(fā)射的，可以考慮，使激發(fā)的熒光偏振各向異性。 各向異性會消失，如果分子旋轉(zhuǎn)在納秒熒光壽命。 然而，由于熒光蛋白大，并慢慢旋轉(zhuǎn)，其熒光不會去極化在測量時(shí)間內(nèi)場進(jìn)行任何重要程度。 如果發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移之間的兩種熒光的蛋白質(zhì)，是稍有錯(cuò)位，那么偏振的熒光發(fā)射，會出現(xiàn)在不同的角度（從激勵(lì)矢量），它模擬了一個(gè)旋轉(zhuǎn)的熒光蛋白。
這種方法的主要優(yōu)勢是易于測量熒光偏振平行和垂直于具有高信號對噪聲的激勵(lì)矢量。 由于極化各向異性數(shù)據(jù)可以迅速獲得與*小圖像處理要求，該技術(shù)非常適合應(yīng)用在高內(nèi)涵篩選。 受體的直接激發(fā)，必須避免，但是，因?yàn)樗梢詼p少供體信號和減少的信號噪聲比的測量。 此外，雖然這項(xiàng)技術(shù)是*的FRET的存在和不存在區(qū)別，它是強(qiáng)與弱之間的FRET區(qū)分不是一個(gè)好方法。 *后，偏振可以降低在高數(shù)值孔徑物鏡，所以偏光FRET實(shí)驗(yàn)應(yīng)限于具有的數(shù)值孔徑為1.0或更小的目標(biāo)成像。
如圖8所示是使用熒光蛋白作為模型系統(tǒng)的偏振各向異性的圖解說明。 當(dāng)被激發(fā)的熒光蛋白（圖8（a））的隨機(jī)取向的人口與直線偏振光（青色波），只有那些分子，其吸收偶極向量取向平行于偏振方位角優(yōu)先興奮。 排放的方向正確的熒光蛋白質(zhì)，可以觀察到作為信號使用的分析儀的激發(fā)光的偏振矢量（綠色波）也平行。 由此產(chǎn)生的各向異性，這是取向度的一個(gè)指標(biāo)，可以通過垂直和水平方向的分析儀，通過測量和比較的發(fā)光強(qiáng)度決定。 的各向異性的信號電平將降低，如果熒光蛋白的旋轉(zhuǎn)在時(shí)間刻度中的實(shí)驗(yàn)（圖8（b））或轉(zhuǎn)移，則其激發(fā)能量，由于FRET具有不同方向的相鄰的蛋白質(zhì)（圖圖8（c））。 如上所述，由于這樣的事實(shí)，可以發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)*過大熒光蛋白分子的分子旋轉(zhuǎn)，去極化由于FRET可以很容易地區(qū)別開來的各向異性，在旋轉(zhuǎn)過程中發(fā)生的損失。
FRET使用熒光蛋白的注意事項(xiàng)
在活細(xì)胞中用于檢查的選擇合適的探針FRET是有限的。 合成熒光，理想的共振能量轉(zhuǎn)移的調(diào)查，在固定的細(xì)胞，是難以管理，并在活細(xì)胞中的物鏡。 同樣，量子點(diǎn)可以利用標(biāo)簽?zāi)ぴM(jìn)行檢查一個(gè)電池的外部的現(xiàn)象，但是，它們也無法滲透膜，因而很少使用如細(xì)胞核，線粒體，內(nèi)質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)隔室網(wǎng)。 目前熒光蛋白基因編碼代表高分辨率成像FRET技術(shù)在活細(xì)胞中，證明了文學(xué)的體積每年的基礎(chǔ)上，在這個(gè)載物臺上發(fā)表的*佳。 但是，許多與合成的熒光基團(tuán)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移和量子點(diǎn)的測量中遇到的典型的工件時(shí)，適用于熒光蛋白是特別嚴(yán)重的。30-40納米合成材料的發(fā)射光譜帶寬相反，例如，熒光蛋白的范圍從約60納米到100納米，往往導(dǎo)致重大重疊時(shí)，試圖分開供體和受體熒光。 熒光蛋白的廣泛的光譜也限制在FRET成像實(shí)驗(yàn)中的其他類型的探針，可以一起使用的數(shù)量。 此外，熒光蛋白表現(xiàn)出很大的差異的亮度水平。 例如，一個(gè)*流行的捐助蛋白質(zhì)，ECFP，亮度比普通的黃色受體的合作伙伴，EYFP少五倍。
熒光蛋白生色周圍是220 +氨基酸多肽纏繞成一個(gè)三維圓柱結(jié)構(gòu)約2.4 4.2納米尺寸（稱為β-桶或β-CAN），組成廣泛的氫鍵多肽β-折疊片包圍和保護(hù)的中心含有的發(fā)色基團(tuán)的α-螺旋結(jié)構(gòu)（見圖9）。 ***管的端部封端的半螺旋的肽區(qū)域，用于阻擋離子和小分子的條目。 如此緊密地包裝內(nèi)部的蛋白質(zhì)是氨基酸側(cè)鏈和水分子，氧，離子或其他侵入管理的小分子，穿過桶的兩端擴(kuò)散的余地不大。 這些有利的結(jié)構(gòu)參數(shù)，這是部分負(fù)責(zé)的彈性的熒光蛋白的耐光性和優(yōu)異的性能，也有助于減少在熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率。 大尺寸的桶，有效地屏蔽相鄰的熒光蛋白發(fā)色團(tuán)與肽殘基（一個(gè)限制的接近距離為2至3毫微米，表示由圖9中的紅線），導(dǎo)致減少的*大熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率約為40理論值的％。 無論如何，F(xiàn)RET成像使用熒光蛋白活細(xì)胞的許多好處遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于成本。
復(fù)合光譜帶寬重疊大小的問題，與發(fā)生熒光蛋白的高度是他們的傾向，低聚。 幾乎所有的熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)至少日期顯示的四級結(jié)構(gòu)中，例如通過弱的傾向，本機(jī)Aequorea victoria的綠色熒光蛋白及其衍生物的二聚化，在高濃度固定時(shí)，在有限的程度。 這種趨勢也驗(yàn)證了原生的黃色，橙色和紅色熒光蛋白在珊瑚和?？ㄟ^嚴(yán)格的四聚動(dòng)機(jī)。 乙烯齊聚在細(xì)胞生物學(xué)中的許多應(yīng)用中，可以是一個(gè)顯著的問題，特別是在熒光蛋白融合到主機(jī)的蛋白質(zhì)，是在一個(gè)特定的亞細(xì)胞定位的目標(biāo)的情況下。 一旦表達(dá)，誘導(dǎo)的熒光蛋白的嵌合體部形成二聚體和更高階低聚物可以產(chǎn)生不正常的本地化，擾亂正常功能，干擾信號級聯(lián)反應(yīng)，或限制的融合產(chǎn)物聚集在一個(gè)特定的細(xì)胞器或細(xì)胞質(zhì)中。 熒光蛋白融合本身參與天然的低聚物形成的貿(mào)易伙伴時(shí)，這種效果是特別顯著。 只有微弱的二聚體（實(shí)際上大多數(shù)水母維多利亞變種）與蛋白質(zhì)形成的Fusion產(chǎn)品可能不會出現(xiàn)聚集或不當(dāng)定位，提供本地化的濃度仍然很低。 然而，弱二聚體的熒光蛋白定位到特定的細(xì)胞區(qū)室，如質(zhì)膜，本地化的蛋白質(zhì)濃度，在某些情況下，成為高到足以使二聚化。 這可以是一個(gè)特定的問題時(shí)，進(jìn)行分子間FRET實(shí)驗(yàn)，可以產(chǎn)生復(fù)雜的數(shù)據(jù)集，通過二聚化偽影，有時(shí)損害。 另一方面，可以是天然存在的弱水母蛋白的二聚化，在某些情況下，用來增加FRET在生物傳感器中的信號，否則將具有有限的動(dòng)態(tài)范圍。
毒性是一個(gè)問題的發(fā)生是由于合成熒光基團(tuán)濃度過高和過度表達(dá)或較差聚集本地化熒光蛋白。此外，健康長壽的*佳標(biāo)記的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在顯微鏡成像室也可以受到由眾多其它有害因素。 其中*重要的是，被熒光標(biāo)記的細(xì)胞反復(fù)暴露到從激光器和高強(qiáng)度的電弧放電燈的照明光引起的損傷（光毒性）。 在它們的激發(fā)態(tài)，熒光分子傾向于與分子氧反應(yīng)，產(chǎn)生自由基，可以破壞亞細(xì)胞成分和危及整個(gè)電池。 熒光蛋白，由于這樣的事實(shí)，他們的熒光基團(tuán)的保護(hù)的多肽包絡(luò)線內(nèi)被深埋，一般都不會對細(xì)胞的光毒性。 在設(shè)計(jì)FRET實(shí)驗(yàn)，熒光蛋白的組合，顯示出可能的*長的激發(fā)波長的選擇應(yīng)以盡量減少對細(xì)胞的破壞，由短波長的照明，特別是在長期的成像實(shí)驗(yàn)。 因此，而不是創(chuàng)造融合的產(chǎn)品和生物傳感器與藍(lán)色或青色熒光蛋白（興奮紫外線和藍(lán)光照明，分別），黃色，橙色和紅色區(qū)域的頻譜發(fā)射的變種，會更理想。
研究者應(yīng)照顧到采用新的熒光蛋白生物傳感器和細(xì)胞系時(shí)，進(jìn)行必要的控制實(shí)驗(yàn)，以確保細(xì)胞毒性和光毒性文物不掩蓋FRET結(jié)果或其他重要的生物現(xiàn)象。 在某些情況下，親脂性試劑誘導(dǎo)熒光蛋白的毒性，在成像過程中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞系，可能會混淆的有害影響。 低聚珊瑚的熒光蛋白（如上所述）有更大的傾向形成聚集體（結(jié)合較差的亞細(xì)胞定位）比單體的水母蛋白，但不正確折疊的融合產(chǎn)品可能發(fā)生的任何變種。 *近，一種熒光蛋白能夠產(chǎn)生活性氧（ROS）照明時(shí)綠燈已被報(bào)告為特定的蛋白質(zhì)失活生色團(tuán)輔助光失活（CALI）的有效藥物。適當(dāng)名為KillerRed的 ，這個(gè)基因編碼的光敏劑是能殺死細(xì)菌和真核細(xì)胞后，在顯微鏡的照明。 EGFP光毒性的以前的研究表明，即使通過發(fā)色團(tuán)是能產(chǎn)生單線態(tài)氧的熒光蛋白作為光敏劑的效率相對較低。 然而，長時(shí)間的照明表達(dá)EGFP的細(xì)胞及其變種可以導(dǎo)致生理改變和*終細(xì)胞死亡，光毒性的潛在的長期成像實(shí)驗(yàn)中一個(gè)明確的信號。
熒光蛋白在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，他們相比合成熒光漂白率減少由于擴(kuò)展成像非常有利的。 雖然是在耐光性方面的熒光蛋白之間的互不相關(guān)的變異程度高，大多數(shù)變體是有用的短期成像（從1到25個(gè)捕獲），而一些更耐光的蛋白質(zhì)，可以采用在時(shí)間推移序列24小時(shí)或更長的時(shí)間跨度期間（聚集數(shù)百至數(shù)千張圖片）。 任何特定的蛋白質(zhì)的長期穩(wěn)定性，但是，必須為每一個(gè)照明場景（寬視場，激光共聚焦，多光子，掃描場，等等）進(jìn)行調(diào)查，因?yàn)樵诠夥€(wěn)定性的差異通常可觀察到由電弧產(chǎn)生照明時(shí)，具有相同的蛋白放電燈相對于激光系統(tǒng)。 因此，在耐光性方面，熒光蛋白的選擇取決于許多參數(shù)，包括照明條件下，表達(dá)系統(tǒng)，成像設(shè)置的有效性。
FRET潛在的熒光蛋白合作伙伴
在過去的幾年中，已開發(fā)出多種新的熒光蛋白變種和改進(jìn)功能，涵蓋了200納米范圍內(nèi)（約450納米至650納米）的排放概況，從而填補(bǔ)了許多空白提供潛在有用FRET合作伙伴每一種顏色類。 發(fā)展在藍(lán)色（440納米到470納米）和青色（470納米到500納米）的蛋白質(zhì)譜地區(qū)的*新進(jìn)展已經(jīng)取得了一些新的探測器，可能是用于成像和FRET調(diào)查。 三蛋白質(zhì)工程的研究小組報(bào)道了改進(jìn)的藍(lán)色水母熒光蛋白的變種，具有顯著更高的亮度和光比EBFP。 名叫石青，SBFP2（堅(jiān)決增強(qiáng)藍(lán)色FP），EBFP2（見表1），這些蛋白質(zhì)提供長期成功的活細(xì)胞成像中的藍(lán)色光譜區(qū)域的*個(gè)真正的希望，都具有重大組合的適用性與EGFP和衍生工具FRET生物傳感器。 *聰明和*耐光的新的藍(lán)色記者，EBFP2個(gè)，表現(xiàn)出典型的融合和GFP類似的行為，已被證明是一個(gè)很好的綠色光譜類蛋白在FRET捐助。 所有的藍(lán)色熒光蛋白可以很容易地在熒光顯微鏡下，使用標(biāo)準(zhǔn)DAPI過濾集或?qū)Ｓ蠦FP集可從廠家售后成像。
青色的光譜區(qū)域中的熒光蛋白已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于FRET捐贈(zèng)者當(dāng)搭配黃色發(fā)光蛋白，主要由變體的原始多管水母 ECFP直到藍(lán)綠色的單體記者，被稱為mTFP1引進(jìn)。青色熒光蛋白具有更高的亮度和酸穩(wěn)定性水母重點(diǎn)計(jì)劃相比，更為耐光。高的發(fā)光量子產(chǎn)率共mTFP1（見表1）提供了一個(gè)很好的替代，以青色衍生物mECFP和mCerulean的，黃色或橙色熒光蛋白結(jié)合時(shí)，作為FRET捐贈(zèng)。其他調(diào)查已經(jīng)產(chǎn)生有用的蛋白質(zhì)在青色譜類。改進(jìn)的青色熒光蛋白，*近被引入其中，CyPet和增強(qiáng)青色變種稱為天藍(lán)顯示*有希望的候選人融合標(biāo)簽，F(xiàn)RET生物傳感器，多色成像。西魯林是至少2倍的亮度*過ECFP，并已被證明是顯著增加對比度，以及信號-to-noise比當(dāng)它與黃色發(fā)射熒光的蛋白質(zhì)，如金星（見下文），在FRET調(diào)查。CFP名為CyPet的變種（的縮寫：CY é能源科技噸轉(zhuǎn)撥熒光P rotein ）來自通過一個(gè)**的戰(zhàn)略，利用FRET配對青色和黃色熒光激活細(xì)胞分選（FACS）來優(yōu)化。CyPet的一半左右光亮如蔚藍(lán)明亮EGFP和三分之二，但表現(xiàn)相對較差，在37攝氏度左右。然而，CyPet有藍(lán)移窄的熒光發(fā)射峰比CFP，這大大增加了其潛在的多色成像。
ECFP的單體的變種到有益的折疊突變的引入導(dǎo)致在生產(chǎn)新的變種，具有增強(qiáng)的亮度，折疊高效，溶解性，熒光共振能量轉(zhuǎn)移的性能。稱為*的重點(diǎn)計(jì)劃（SCFPs），新的記者是顯著的亮度比親本蛋白在細(xì)菌中表達(dá)時(shí)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的幾乎2倍的更亮。這些高性能探頭應(yīng)該是有用的例行融合標(biāo)簽，并創(chuàng)造新的CFP-YFP FRET生物傳感器具有高動(dòng)態(tài)范圍。另一種新的單體青色記者，TagCFP，是來自一個(gè)從水母水母macrodactyla的 GFP類似的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的具體的細(xì)節(jié)是無法在文學(xué)，但它是市售哺乳動(dòng)物克隆載體和融合Evrogen的。TagCFP據(jù)報(bào)道，明亮的ECFP和西魯林相比，但類似的耐酸性。另一個(gè)青色發(fā)光蛋白，Midoriishi青色（簡稱MiCy）*初被設(shè)計(jì)為在新的捐助FRET單體Kusabira橙（人民圣戰(zhàn)者組織見表1）結(jié)合產(chǎn)生的生物傳感器具有高光譜重疊（福斯特的距離為5.3） 。這種蛋白質(zhì)具有吸收和發(fā)射波長*長的配置文件（分別為472和495納米）報(bào)告青色光譜區(qū)域中的任何探頭。由MiCy展出的高摩爾消光系數(shù)和量子產(chǎn)率，使亮度相同的蛋白質(zhì)就是藍(lán)。
FRET對屬性的選擇熒光蛋白
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表1
目前*好的選擇活細(xì)胞成像FRET記者在綠色類（500納米到525納米），其中有EGFP父性質(zhì)類似于GFP衍生翡翠 。 翡翠包含EGFP F64L和S65T突變的特色，但該變種還具有四個(gè)額外的點(diǎn)突變，提高折疊，在攝氏37度的表達(dá)，和亮度。 *近，一個(gè)新的綠色光譜區(qū)域已經(jīng)創(chuàng)造*折疊GFP，這是更明亮，更耐酸比EGFP或翡翠，也有類似的耐光性。 因此，*折疊變應(yīng)與哺乳動(dòng)物蛋白的融合是一個(gè)出色的候選人，并建設(shè)FRET生物傳感器，尤其是那些展示折疊的問題，標(biāo)準(zhǔn)的綠色熒光蛋白衍生物。 另一個(gè)明亮的熒光報(bào)道，這可能是一個(gè)很好的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的候選，被稱為AZAMI綠色，并已被隔離從石珊瑚Galaxeidae的 ，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中的表達(dá)過程中表現(xiàn)出快速成熟。 此外，還有兩個(gè)明亮，單體獲得的GFP記者通過現(xiàn)場指導(dǎo)和隨機(jī)突變庫篩選青色蛋白結(jié)合已有報(bào)道。 來自的Clavularia珊瑚屬，mWasabi是一個(gè)潛在的替代綠色發(fā)光FRET藍(lán)色熒光蛋白由于微不足道的吸光度在400納米的合作伙伴和更低的藍(lán)色變種往往興奮。 新綠記者市售（等位基因Biotechnology公司）和兩色成像連同長的斯托克斯位移（Stokes shift）的蛋白質(zhì)（如T-藍(lán)寶石 ），以及與目標(biāo)蛋白的融合本地化標(biāo)簽應(yīng)該是特別有用的。 的衍生物TagCFP，名為TagGFP，是一個(gè)充滿生機(jī)和單體綠色的變種，具有吸收*大發(fā)射482納米和505納米。 ，這是TagGFP只是稍微比EGFP亮，可作為克隆載體和融合從Evrogen標(biāo)簽，但一直沒有得到徹底的特點(diǎn)文獻(xiàn)報(bào)道。
黃色熒光蛋白（525納米到555納米）是*多才多藝的基因編碼的探頭，并應(yīng)提供考生作為供體和受體雙方FRET配對。 該變種水晶和金星被稱為是目前*有用的蛋白質(zhì)在這個(gè)光譜類（見表1），但也不是市售的。 Invitrogen公司提供的另一個(gè)變種，命名誕生后黃玉 ，是已經(jīng)融合標(biāo)簽定位，細(xì)胞內(nèi)信號的服務(wù)，和FRET調(diào)查。 的Evrogen“標(biāo)簽”商用系列的本地化記者蛋白，TagYFP的新成員是一個(gè)單體水母（ 大型多管水母 ）衍生物比EYFP略低的明亮，但為了更耐光的幅度。 其合作伙伴相似，TagYFP（發(fā)光峰值在524納米）的特點(diǎn)在文獻(xiàn)中，但可以購買哺乳動(dòng)物克隆載體或融合標(biāo)簽。
在相同的熒光激活細(xì)胞分選的調(diào)查導(dǎo)致的代CyPet的（上面討論的），進(jìn)化優(yōu)化的互補(bǔ)FRET受體，稱為YPET，也被得到。 命名后，其熟練FRET（Y F P電子能源科技轉(zhuǎn)移 ），YPET尚未開發(fā)并演示了合理的耐光性是亮黃色的變種。 抵抗酸性的環(huán)境所提供YPET是優(yōu)于金星和其他YFP的衍生工具，這將增強(qiáng)系統(tǒng)的效用，這個(gè)探頭針對酸性細(xì)胞生物傳感器組合。 然而，雖然CyPet YPet優(yōu)化組合應(yīng)該是的*首發(fā)點(diǎn)在開發(fā)新的FRET生物傳感器，那里仍然是一個(gè)嚴(yán)重的疑問的起源YPET增加的性能，這是可能由于簡單地增強(qiáng)二聚，其共同的進(jìn)化合作伙伴，CyPet。 同樣的，本地化的實(shí)驗(yàn)中，雙分子互補(bǔ)分析和其他應(yīng)用程序的融合標(biāo)簽為中CyPet YPET的適宜性尚未建立起來。 存在這兩種蛋白質(zhì)在溶液中為弱的二聚體，但據(jù)推測，可以被轉(zhuǎn)換成真實(shí)使用A206K工作的突變，以及與其他多管水母的變種（雖然這顯然破壞了它們的優(yōu)點(diǎn)在FRET）的單體。
橙色熒光蛋白，所有這些都被隔離從珊瑚礁物種，有可能是有用的在各種FRET成像場景。 也許*多才多藝的這些是從蘑菇珊瑚Fungia黃果厚殼桂 （稱為日本為Kusabira艾希 ）*初是作為一個(gè)四聚體，蛋白質(zhì)單體Kusabira橙色。（簡稱人民圣戰(zhàn)者組織）Kusabira橙單體版本創(chuàng)建引入*過20突變，通過現(xiàn)場指導(dǎo)和隨機(jī)突變。的單體（市售從MBL國際）的四聚體具有相似的光譜特性，并具有類似EGFP的亮度值，但稍微敏感的酸性環(huán)境中，比它的父。然而，本報(bào)記者的耐光性，是名列前茅的任何蛋白質(zhì)在所有的光譜類，使人民圣戰(zhàn)者組織長期成像實(shí)驗(yàn)的*佳選擇。此外，發(fā)射光譜輪廓充分分離從青色熒光蛋白的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率增加人民圣戰(zhàn)組織結(jié)合在生物傳感器中，探針是有用的在多色調(diào)查與青色，綠色，黃色和紅色的探針的組合。
尋找一個(gè)理想的紅色發(fā)光熒光蛋白長期以來一直使用活細(xì)胞和整體動(dòng)物成像的目標(biāo)FRET生物傳感器和融合，主要是由于在這個(gè)光譜區(qū)域的探頭在多色成像實(shí)驗(yàn)的要求，以及事實(shí)較長的激發(fā)波長產(chǎn)生更少的光毒性和可以探測到生物組織更深。 至目前為止，已廣泛的潛在有用的紅色探頭（排放量在590納米至650納米），其中許多仍然受到一定程度的強(qiáng)制性的四級結(jié)構(gòu)賦予原籍物種。 與水母蛋白不同的是，大多數(shù)的本地和基因工程的珊瑚礁蛋白變體的成熟非常有效地在37度。 廣泛的誘變研究努力，包括新近引入的方法，已成功地應(yīng)用在搜索中為黃色，橙色，紅色，和遠(yuǎn)紅熒光蛋白變異，從而進(jìn)一步降低的傾向，這些潛在的有效的生物探針自交聯(lián)，同時(shí)推動(dòng)排放*大值向更長的波長。 結(jié)果已改進(jìn)的單體蛋白質(zhì)，具有消光系數(shù)增加，量子產(chǎn)率，和光，雖然沒有一個(gè)單一的變種尚未優(yōu)化的所有標(biāo)準(zhǔn)。
紅色mFruit蛋白，MAPPLE（mCherry mStrawberry的發(fā)射峰位于592，610和596納米，分別），有亮度級別范圍從50％到110％的綠色熒光蛋白，但馬普爾和mCherry得多比mStrawberry耐光和的*佳探頭的選擇長期成像實(shí)驗(yàn)，以取代mRFP1。進(jìn)一步延長的mFruit蛋白質(zhì)譜類通過迭代產(chǎn)生了兩個(gè)新的熒光蛋白突變體與*大發(fā)射波長625納米和649納米，相當(dāng)于*個(gè)真正的遠(yuǎn)紅遺傳工程探頭。此語言對的*有可能有用的探針被評為mPlum的，它具有相當(dāng)有限的亮度值（10％的EGFP），但優(yōu)良的耐光性。這種單體的探針的組合應(yīng)該是有用的，與變體排放，青色，綠色，黃色和橙色區(qū)域的多色成像實(shí)驗(yàn)中，作為生物傳感器的熒光共振能量轉(zhuǎn)移與綠色和黃色的蛋白質(zhì)，如綠寶石和黃晶（參見圖10）的合作伙伴。礁珊瑚生物已分離出一些額外的紅色熒光蛋白呈現(xiàn)不同程度的承諾。應(yīng)用程序的位點(diǎn)特異性和隨機(jī)誘變，然后通過篩選的突變顯示出遠(yuǎn)紅熒光的TurboRFP變種，導(dǎo)致一種二聚體蛋白質(zhì)名為Katushka（發(fā)射*大值為635納米）。盡管只有三分之二光亮如綠色熒光蛋白，Katushka展品涵蓋650至800納米，一個(gè)地區(qū)是重要的深層組織成像光譜窗口中的任何熒光蛋白的亮度*高水平。介紹到TagRFP的的四個(gè)主要Katushka突變產(chǎn)生的單體，遠(yuǎn)紅蛋白名為mKate，具有相似的光譜特征。耐光mKate報(bào)道是例外和蛋白質(zhì)mCherry，這使得它一個(gè)很好的候選人本地化和遠(yuǎn)紅光部分頻譜FRET實(shí)驗(yàn)顯示亮度類似。
盡管擴(kuò)大到橙色，紅色，和遠(yuǎn)紅外光譜區(qū)的熒光色調(diào)色板的顯著的進(jìn)步，青色和黃色的僧帽衍生物仍是*有用的配對場景開發(fā)有用的生物傳感器。這場突如其來的差異發(fā)生，因?yàn)榇蟛糠值某壬图t色珊瑚源性蛋白表現(xiàn)出一個(gè)比較寬泛的吸收光譜曲線有一個(gè)長期的激勵(lì)尾部延伸到紫色和青色區(qū)域，從而產(chǎn)生直接受激勵(lì)。可能開始發(fā)揮作用的另一個(gè)因素是相對成熟率熒光蛋白融合伙伴。在大多數(shù)情況下，從多管水母蛋白衍生的變種的成熟速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)*過造礁珊瑚得到的，所以它是可能的，不成熟的受體，有助于所表現(xiàn)出許多的珊瑚來源的蛋白質(zhì)的敏化發(fā)射差。此外，廣泛的吸附光譜的橙色和紅色的蛋白，結(jié)合的單體版本的量子產(chǎn)率減少，有可能使它們很難用于FRET。FRET熒光蛋白未來的成功將重點(diǎn)放在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，除其他因素外，配對的蛋白質(zhì)相匹配的成熟率。
結(jié)論
雖然提供了巨大的潛力，在活細(xì)胞系統(tǒng)，尚未揭示分子動(dòng)力學(xué)FRET實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上無處不在的熒光蛋白家族是不是有一個(gè)**的FRET對。 CFP和YFP的優(yōu)化版本仍然為一般用途，提供*有效的對更好的組合，雖然可能籠罩在地平線上。 同樣地，也沒有**的技術(shù)，測量熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），上述所有的方法雖然有優(yōu)勢，取決于特定的實(shí)驗(yàn)調(diào)查的情況下，可以利用。 更優(yōu)化的熒光蛋白成為包括鮮紅的變種，可能是適當(dāng)?shù)氖荏w為GFP或YFP捐助者的，F(xiàn)RET使用熒光蛋白在活細(xì)胞中蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用的調(diào)查變得更加有用。 如所討論的，寬的吸收光譜的紅色熒光蛋白的當(dāng)前調(diào)色板，除了單體版本的量子產(chǎn)率較低，這些候選者難以采用在熒光共振能量轉(zhuǎn)移。 然而，快速的步伐熒光蛋白改進(jìn)借給樂觀，這種蛋白質(zhì)會在不久的將來，將有助于進(jìn)一步改變這種新的方法來闡明細(xì)胞內(nèi)生化機(jī)制。