熒光是一個(gè)過(guò)程，其中已吸收的光（光子）后的物質(zhì)emitts的輻射的波長(zhǎng)（顏色），其中長(zhǎng)于吸收光，這個(gè)排放停止后立即停止激發(fā)。這種現(xiàn)象是熒光顯微鏡及其應(yīng)用的基本元素。

除此之外，“古典”在光學(xué)顯微鏡下的熒光激發(fā)，有可能兩個(gè)或多個(gè)光子具有較長(zhǎng)wavengths比發(fā)射的激發(fā)激光共聚焦掃描顯微鏡通過(guò)現(xiàn)代技術(shù)來(lái)獲得相同的發(fā)光效果。

與今天的情況相比，在第一次施加透射光場(chǎng)和暗場(chǎng)顯微鏡的使用熒光顯微鏡。這是由于其有限的護(hù)林員在那些日子里的應(yīng)用。但隨著組織學(xué)，細(xì)胞學(xué)，分子生物學(xué)和免疫診斷其重要性日益增加的需求，從根本上改善照明和觀測(cè)技術(shù)來(lái)越來(lái)越多。這是入射光熒光顯微鏡誕生的時(shí)刻。

在其近40年的應(yīng)用和發(fā)展的過(guò)程中，這種技術(shù)成為常規(guī)和科研工作，在生物學(xué)，醫(yī)學(xué)，科學(xué)和工業(yè)的基本工具之一。入射光熒光顯微鏡的進(jìn)步，尤其是由研究工作Ploem的他的功能引領(lǐng)趨勢(shì)也正向萊茨RESP戰(zhàn)略決定。韋茨拉爾徠卡光學(xué)儀器發(fā)展需要。

這個(gè)發(fā)展過(guò)程中是按時(shí)間順序描述在目前的貢獻(xiàn)。à提要熒光顯微鏡技術(shù)使顯微鏡，物鏡，熒光染料，光源和過(guò)濾系統(tǒng)有關(guān)的應(yīng)用領(lǐng)域，并指這方法的相關(guān)信息。

熒光

熒光是一種分子的現(xiàn)象，其中一種物質(zhì)的光吸收（激發(fā)）和輻射光的較長(zhǎng)的波長(zhǎng)（發(fā)射），在很短的一段時(shí)間內(nèi)。當(dāng)熒光染料吸收光能量的光子的形式，導(dǎo)致的電子激發(fā)到較高的能態(tài)。光子吸收的過(guò)程中，非常迅速，后面緊跟著一個(gè)返回較低的能量狀態(tài)，然后，伴隨著輻射產(chǎn)生的光子，如果在視覺(jué)范圍內(nèi)的光發(fā)射，可以觀察到。

這短短的時(shí)間（納秒），使其區(qū)別于其他形式的如磷光發(fā)光。在激發(fā)和發(fā)射峰的波長(zhǎng)之間的差異被稱(chēng)為斯托克斯位移（Stokes shift）。具有較大的斯托克斯位移的熒光染料很容易激發(fā)和熒光顯微鏡觀察其排放。透射光照明下，小斯托克斯位移可能使其無(wú)法照亮熒光激發(fā)峰和，觀察熒光色在其發(fā)射峰。

共焦激光掃描熒光顯微鏡使比所發(fā)射的光的波長(zhǎng)越長(zhǎng)的光子與雙光子激發(fā)。然后使電子激發(fā)態(tài)所需要的能量的一半的兩個(gè)光子同時(shí)到達(dá)。在大多數(shù)情況下，結(jié)束了在同樣興奮的狀態(tài)，與正常的單光子激發(fā)電子之前下降到基態(tài)。同樣地，發(fā)射的熒光發(fā)出了由正常的單光子激發(fā)的是類(lèi)似的。

熒光染料

許多分子，非有機(jī)和有機(jī)，顯示熒光，尤其是使用高能輻射激發(fā)。當(dāng)植物或動(dòng)物組織的興奮與UV光很多時(shí)候，觀察到一個(gè)藍(lán)色的熒光發(fā)射，這被稱(chēng)為初級(jí)熒光，或自體熒光。天然存在的物質(zhì)通常有很寬的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究已集中在特殊染料與明亮的熒光，以區(qū)別于可能自發(fā)熒光。用于選擇性地染色重要的生物分子的染料被稱(chēng)為熒光染料。當(dāng)共軛的抗體或核酸，它們被稱(chēng)為作為熒光標(biāo)記物或探針。今天，熒光染料可與峰值發(fā)射在紫，藍(lán)，綠，橙，紅和近紅外光譜區(qū)。用橙色和紅色的光來(lái)激發(fā)熒光染料和檢測(cè)的紅光和紅外光的熒光用光電倍增管或CCD相機(jī)的可能性已擴(kuò)展的可視范圍以外的熒光顯微鏡。熒光的激發(fā)和發(fā)射的可能轉(zhuǎn)向細(xì)胞環(huán)境的變化。某些染料，尤其是選擇，因?yàn)樗鼈兊募ぐl(fā)或發(fā)射光譜移出后，在細(xì)胞內(nèi)的介質(zhì)（如鈣，鈉，pH值）中的一些離子的濃度變化。

落射熒光顯微鏡的早期發(fā)展

對(duì)于熒光顯微鏡的歷史評(píng)論的讀者被稱(chēng)為卡斯滕。EPI照明（垂直入射激發(fā)光）已經(jīng)Policard和Paillot的。一些工具由徠茲（徠卡），博士倫博士倫，賴(lài)克特和蔡司，其中部分建議的基礎(chǔ)上的Ellinger和希爾特，歌手：梅勒和匹克。一個(gè)早期的萊茨（徠卡）熒光落射照明系統(tǒng)由Haitinger描述。欲了解更多詳細(xì)信息，落射熒光顯微鏡的演變，讀者可以參考羅斯特和入射光熒光顯微鏡早期應(yīng)用豪瑟。

落射熒光顯微鏡中的一個(gè)主要貢獻(xiàn)是事故照明引進(jìn)雙色鏡UV光由布倫伯格和Krylova的。具有一定的落射照明光的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)椴幌裢干湔彰鳎?a title='聚光鏡' target='_blank' class='seolabel'>聚光鏡和物鏡物鏡有獨(dú)立的光軸必須完全一致。的物鏡函數(shù)作為聚光鏡作為聚光的物鏡，避免了所有的對(duì)齊的問(wèn)題。分離自激發(fā)光的熒光發(fā)射，使用分色beamspitter，容易得多與transmittted光熒光顯微鏡，這些可能性沒(méi)有，但是，不會(huì)導(dǎo)致常規(guī)熒光顯微鏡落射照明工業(yè)顯微鏡制造商普遍接受。這種情況的主要原因可能已經(jīng)透射光的暗視野紫外光的激發(fā)熒光顯微鏡在大多數(shù)應(yīng)用中，給已經(jīng)很優(yōu)秀的結(jié)果。其更換紫外落射照明不會(huì)有顯著的優(yōu)勢(shì)。使用暗場(chǎng)聚光鏡的透射光的使用仍是行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，直到60年代后期。

分子生物學(xué)的興趣迅速增長(zhǎng)，但是，導(dǎo)致許多抗體（單抗）的發(fā)展的重要的大分子在細(xì)胞檢測(cè)。要研究具體的幾個(gè)大分子細(xì)胞器的形態(tài)位置，用不同顏色的熒光標(biāo)記物被越來(lái)越多地使用。紫外光激發(fā) - 傳統(tǒng)熒光顯微鏡的使用 - 不是最適合同時(shí)檢測(cè)多種熒光染料，在一個(gè)單元格。

1962 Ploem左右開(kāi)始工作，與Schott合作的發(fā)展分色beamspitters的藍(lán)色和綠色的光反射熒光顯微鏡落射照明。當(dāng)時(shí)他的第一個(gè)通信[1965]和落射照明出版物窄帶的藍(lán)色和綠色的光，他是不知道的紫外光激發(fā)分色分光器的開(kāi)發(fā)與入射光布倫伯格和Krylova的。也不是徠茲公司，而他獲得的的“Opak”落射照明用中性分光鏡。此照明燈進(jìn)行修改，以在入射光路包含四個(gè)分色分束器包含一個(gè)滑塊，分別為紫外線，紫色，藍(lán)色和綠色激發(fā)光。此裝置，在阿姆斯特丹大學(xué)的發(fā)展，允許不同的分色分束器輕松地交換入射光路（圖1a）。的激發(fā)光的波長(zhǎng)，因此可以很容易地和迅速地改變。

圖 1a的：熒光多wavelenghts的落射照明器與四個(gè)二色光束分離器安裝在一個(gè)滑塊上，用紫外線入射照明，紫色，藍(lán)色和綠色的激發(fā)光的。建在阿姆斯特丹大學(xué)（Ploem，1965）。

圖 1b中：萊茨原型（沒(méi)有商業(yè)化的）與4個(gè)二向色分束器安裝在一個(gè)滑塊（Ploem，1967）的多波長(zhǎng)的落射照明。

圖 1C：萊茨落射照明器與四個(gè)可交換濾光塊（塊）（卡夫，1972）。

不久與窄帶藍(lán)色和綠色的光激發(fā)它變得清晰，廣泛應(yīng)用于免疫熒光異硫氰酸酯（FITC）和異硫氰酸四甲（TRITC）標(biāo)簽檢測(cè)開(kāi)辟了最佳的可能性。使用的藍(lán)色和綠色的激發(fā)也最小化的自體熒光的組織成分，與傳統(tǒng)的透射照明用UV光遇到不期望的效果。FITC現(xiàn)在可以興奮與窄帶藍(lán)色光（使用濾除帶外干擾的半寬度為16nm），在490 nm處（長(zhǎng)波長(zhǎng)藍(lán)色）的最大激發(fā)，清楚地觀察到綠色熒光發(fā)射峰在520納米。最小化組織成分的自體熒光（圖2a和b），在一個(gè)高的圖像對(duì)比度。激發(fā)FITC接近其最大激發(fā)啟用，即使是高壓汞弧燈，有沒(méi)有強(qiáng)烈的排放峰值在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍內(nèi)，可以用這樣一個(gè)高效的激勵(lì)。此外，落射照明用的第一次啟動(dòng)，激發(fā)富爾根副薔薇苯胺的強(qiáng)汞（圖3a和b）在546 nm處的發(fā)射譜線的綠色反射分色鏡。

圖 2A：照亮寬波段紫外線激發(fā)與immunolabel（FITC）標(biāo)記的組織細(xì)胞。注意藍(lán)色自發(fā)熒光的組織結(jié)構(gòu)。

圖 2B：相同的組織和相同的免疫染色FITC標(biāo)記落射照明使用窄帶藍(lán)色（490 nm）的光照亮。請(qǐng)注意，增加圖像的對(duì)比度（Ploem，1967）。

圖 3A：肝組織。細(xì)胞核染色進(jìn)行DNA Feulgen反應(yīng)pararosanilin的，可視化與傳輸綠燈。這污點(diǎn)被稱(chēng)為吸收污漬，不知道是熒光。在晶核上亮起，導(dǎo)致事件窄帶綠光（546 nm）的紅色熒光。

圖 3B：肝組織。核Feulgen反應(yīng)副玫瑰苯胺染色的DNA。落射照明與窄帶綠光（546納米）和二色分光鏡反射綠燈。大概顯微鏡用綠光激發(fā)（Ploem，1965）的第一個(gè)例子。注意：大的圖像對(duì)比度。

在他的第二次出版的多波長(zhǎng)落射照明器，描述一個(gè)的萊茨原型與四分色光束spittters（圖1b），Ploem 承認(rèn)布倫伯格和Krylova的貢獻(xiàn)。俄羅斯在這一段時(shí)間的研究，沒(méi)有任何主要的工業(yè)發(fā)展在俄羅斯或東德落射熒光顯微鏡的交通不便是萊茨沒(méi)有意識(shí)到這樣的發(fā)展早的原因。引進(jìn)外延照明，紫外線，雖然有用的幾個(gè)應(yīng)用程序，沒(méi)有被萊茨一個(gè)新的技術(shù)發(fā)展的動(dòng)機(jī)，因?yàn)樗麄円呀?jīng)出色的傳輸暗場(chǎng)紫外光激發(fā)的可能性。增加世界廣泛使用的常規(guī)熒光顯微鏡在醫(yī)療診斷和分子生物學(xué)研究，然而，利潤(rùn)落射照明使用窄帶激發(fā)新的可能性，用藍(lán)色和綠色的光。由于可以使用標(biāo)準(zhǔn)的高壓汞弧燈，這似乎是一個(gè)實(shí)際的建議。

隨后，徠茲分別紫外線，紫色，藍(lán)色和綠色的光開(kāi)發(fā)了一種新穎多波長(zhǎng)熒光epiilluminator的四個(gè)旋轉(zhuǎn)分色分光鏡（徠茲PLOEMOPAK） 。萊茨照明（包含四個(gè)分色分光鏡）屏障過(guò)濾器和旋轉(zhuǎn)炮塔激發(fā)濾光片在連續(xù)幾代增加了。最后一個(gè)優(yōu)雅的落射照明，構(gòu)建了卡夫含有多組的激發(fā)濾光器，二向色分束器和一個(gè)阻擋或發(fā)射濾波器的組合，一起安裝在過(guò)濾器中的多維數(shù)據(jù)集，也稱(chēng)為過(guò)濾器塊（圖4）。由于此照明燈迅速變成光路允許過(guò)濾立方體，多波長(zhǎng)照明同款組織成為一個(gè)實(shí)用的命題。此外，四個(gè)過(guò)濾器的照明器中的多維數(shù)據(jù)集可被交換由用戶(hù)（圖1c）。兩套不同的四個(gè)濾光塊進(jìn)行組裝，選擇從許多濾光塊，包含組合的激發(fā)，阻隔過(guò)濾和分色分束器，為不同的應(yīng)用程序開(kāi)發(fā)。經(jīng)過(guò)建議Ploem，利時(shí)也產(chǎn)生了一個(gè)倒置的顯微鏡落射照明（圖5a和b）。多波長(zhǎng)熒光顯微鏡的的萊茨PLOEMOPAK照明的審查，被稱(chēng)為讀者評(píng)論普盧塔。

左：圖。4：完成萊茨（徠卡）過(guò)濾器的立方體（塊）含有熒光顯微鏡：激發(fā)濾光片，分色分束器和發(fā)射濾波器（壘）。

圖 5A：徠卡倒置熒光顯微鏡，多波長(zhǎng)落射照明。

圖 5B：寺崎?塑料托盤(pán)與人類(lèi)淋巴細(xì)胞移植研究后熒光細(xì)胞毒性試驗(yàn)。倒置顯微鏡落射照明。

圖 5C：徠茲（徠卡）機(jī)動(dòng)落射照明器與八個(gè)濾光塊（塊）。

徠茲（徠卡）濾波器立方體系統(tǒng)是如此的高效，現(xiàn)在，39年后，相似類(lèi)型的過(guò)濾器立方體仍然使用多波長(zhǎng)熒光顯微鏡最顯微鏡制造商。這種發(fā)展最終導(dǎo)致在徠卡的發(fā)展，自動(dòng)化的多波長(zhǎng)熒光落射照明器，可容納8個(gè)濾光塊不同的波長(zhǎng)范圍（圖5c）。當(dāng)過(guò)濾立方體，電腦顯示器上的像素移位避免或保持在低于35 mm膠片由于0像素移位技術(shù)的分辨能力之間切換。此照明燈是現(xiàn)在使用的熒光原位雜交方法（FISH）染色體的研究。

Ploem  ，范德Ploeg Ploem的和奈恩和Ploem [ 進(jìn)一步探索過(guò)濾器的組合，許多醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用也得到了發(fā)展。這樣做是與肖特和Leitz合作。Rygaard和奧爾森等人開(kāi)發(fā)了一種新型的短波通高傳輸干擾濾波器具有非常高的傳輸和尖銳切斷對(duì)波長(zhǎng)大于490納米的藍(lán)色光。

Ploem 結(jié)合SP濾波器與1毫米GG 455過(guò)濾器，阻止紫外線激發(fā)，肖特和建議的綠色光激發(fā)和激發(fā)一個(gè)過(guò)濾器Balzers公司開(kāi)發(fā)的類(lèi)似的過(guò)濾器（SP 560 = KP 560）紫光（LP 425 = KP 425）。后者過(guò)濾器適用于神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)查。在圖6a和b中得到的藍(lán)色熒光可以觀察到。

圖 6a的藍(lán)色熒光腎上腺素（加利福尼亞州）的神經(jīng)叢和黃色熒光肥大細(xì)胞（5-HT）所包圍的小血管的大鼠腸系膜。甲醛誘導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)的CA和5-HT的熒光基團(tuán)的熒光。

圖 6B：相同的組織和染色圖。6A：EPI-窄帶紫色激發(fā)光照明（LP 3毫米GG 400和SP（KP）425干擾過(guò)濾器），分色分束器495納米，反映了紫光和屏障過(guò)濾器LP 460納米。該過(guò)濾器立方體permittted的第一次觀察藍(lán)色熒光腎上腺素能神經(jīng)纖維，明顯不同的從黃色熒光肥大細(xì)胞（Ploem，1971）。

從眼鏡行業(yè)方面，早對(duì)這些發(fā)展中的貢獻(xiàn)和評(píng)論寫(xiě)卡夫，沃爾特，特拉普和赫爾佐格。

落射熒光顯微鏡中使用的過(guò)濾器中定義的主類(lèi)（一）主要激發(fā)濾光片LP（長(zhǎng)傳）和SP（短傳） -德國(guó)文學(xué)被稱(chēng)為KP過(guò)濾-及（b）二級(jí)過(guò)濾器作為屏障過(guò)濾器和發(fā)射濾波器等。后者也被稱(chēng)為熒光選擇過(guò)濾器，例如用于限制FITC熒光峰值在520 nm處觀察到這些。熒光顯微鏡的過(guò)濾器已被賦予由賴(lài)希曼最近的一項(xiàng)廣泛的審查。

Cormane 首次證明，窄帶藍(lán)色光落射熒光標(biāo)記FITC免疫人體皮膚疾病的研究中得到最佳的對(duì)比度。透射光激發(fā)紫外線燈，用來(lái)引起如此強(qiáng)烈的自體熒光在皮膚的彈性纖維，使可視化熒光抗體嚴(yán)重阻礙。

在七十年代的開(kāi)創(chuàng)性工作萊茨落射熒光顯微鏡恰逢一個(gè)世界性的增加免疫和其他分子生物學(xué)方法，像魚(yú)在醫(yī)學(xué)診斷和研究中的應(yīng)用。hijmans等。首次證明萊茨新的多波長(zhǎng)激發(fā)落射照明的實(shí)用性，對(duì)于某些類(lèi)別的免疫球蛋白細(xì)胞的選擇性檢測(cè)，使用綠色熒光FITC和紅色熒光TRITC抗體共軛。他們應(yīng)用的兩個(gè)波長(zhǎng)的激發(fā)方法，使用藍(lán)色和綠色的光的選擇由一個(gè)發(fā)射濾光器在520nm處（圖7）的FITC熒光峰值。brandtzaeg 和Klein等。有類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)，識(shí)別免疫重要的細(xì)胞類(lèi)型，使用雙波長(zhǎng)激發(fā)萊茨epiilluminator的。在染色血“玫瑰花結(jié)”的形成，使用UV和綠色的光的兩個(gè)波長(zhǎng)的激發(fā)方法，可以顯示紅細(xì)胞周?chē)膯魏思?xì)胞（圖8）。

圖 7：骨髓細(xì)胞的抗-κB的TRITC共軛的抗-IgG FITC共軛染色。的EPI-illmination窄帶綠色和藍(lán)色光，導(dǎo)致TRITC和綠色熒光的細(xì)胞含有FITC標(biāo)記的細(xì)胞中含有的紅色熒光。一些細(xì)胞中含有FITC和TRITC。

圖 8：人體血液細(xì)胞，“花環(huán)”的形成。藍(lán)色熒光染色芪使用外延照明用紫外光紅細(xì)胞染色。淋巴細(xì)胞激發(fā)后的綠色光（1965）與橙紅色的染色曙紅染色。

EPI照明

在落射照明，二向色分束器，用于對(duì)試樣的入射光偏轉(zhuǎn)。已經(jīng)設(shè)計(jì)了這樣一種方式，只有所需的激發(fā)波長(zhǎng)的向下偏轉(zhuǎn)，通過(guò)物鏡到標(biāo)本，而不需要的波長(zhǎng)的傳輸由分色鏡，在光收集器收集后面的分色鏡的光譜特性二向色鏡。消除這種不必要的激發(fā)光結(jié)果在顯著減少雜散光，從而提高圖像對(duì)比度。二色鏡偏轉(zhuǎn)所需位置（短波長(zhǎng)）的激發(fā)光通過(guò)物鏡到樣品上，但較長(zhǎng)的熒光波長(zhǎng)是透明的。抑制濾波器（屏障過(guò)濾器）吸收（或反射）從試樣和物鏡的透鏡表面反射的激發(fā)光，但是高度透明的熒光，從而可以達(dá)到目鏡。落射照明的效率是與一個(gè)物鏡的數(shù)值孔徑（NA）的四次方，在落射照明第一服務(wù)作為聚光鏡，然后作為一個(gè)聚光透鏡觀察。在營(yíng)銷(xiāo)的時(shí)候第一個(gè)多波長(zhǎng)外延照明高功率的物鏡（X70，X100）提供高NA（0.95，1.30）。繼Ploem建議萊茨，是世界上第一家生產(chǎn)中等功率的物鏡，如油浸X40物鏡NA為1.30（圖9）。這種新型的設(shè)計(jì)物鏡，尤其是落射熒光顯微鏡，導(dǎo)致常規(guī)熒光顯微允許短的曝光時(shí)間在非常明亮的圖像。

右：圖。9：徠茲（徠卡）早期（1967年）的原型（“Versuchs”）油浸物鏡X40與NA 1.30熒光落射照明技術(shù)開(kāi)發(fā)的中試實(shí)驗(yàn)。

最優(yōu)填充的入射光瞳（光圈）的物鏡

落射熒光顯微術(shù)中的一個(gè)問(wèn)題一直是最佳的光源的圖像中的物鏡的入射光瞳填充。約8倍的光源是典型的中等倍率。這是相關(guān)的不同的各種高壓汞和氙氣燈的電弧大小。此外，高考學(xué)生的物鏡有很大的不同，例如，3.6毫米的X100，NA 0.90物鏡和12毫米的10倍，NA 0.30物鏡。此外，如果只有一部分的圓弧可以進(jìn)入的入射光瞳，得到的熒光強(qiáng)度將會(huì)減弱。最近Sch?nenborn的報(bào)道在一個(gè)完全創(chuàng)新的事件在Leica DM R（HCS）顯微鏡的光路。落射照明的路徑現(xiàn)在已經(jīng)被設(shè)計(jì)為允許個(gè)人適應(yīng)用于不同的應(yīng)用的具體光源的照明光的路徑。假設(shè)科勒照明入射光路徑，就是將圖像的照明光學(xué)系統(tǒng)的組合和集電極中的光源的入射光瞳的物鏡。對(duì)于一個(gè)給定的物鏡，光源的放大率的選擇直接取決于其幾何尺寸。鹵素?zé)魬?yīng)該很清楚地調(diào)整，由于線圈燈絲燈絲失調(diào)引起的極端敏感性。然后建議相對(duì)較低的放大倍率。

在一些應(yīng)用中，可以在熒光強(qiáng)度增加了1.8倍，并在紫外線范圍內(nèi)的工業(yè)應(yīng)用中，即使由系數(shù)為3.5，在DM R（HCS）顯微鏡。在紫外范圍內(nèi)的增加已經(jīng)得到了一個(gè)新的色校正6透鏡的特殊的高傳輸玻璃類(lèi)型的集電極。在Leica DM R（HCS）的顯微鏡系統(tǒng)的兩個(gè)模塊，現(xiàn)已：與HC F模塊的照明光學(xué)系統(tǒng)的倍率為11.5，和為HC射頻模塊倍率為4.8。此外，在Leica DM R（HCS）落射照明支架HC F模塊，產(chǎn)生非常高的熒光強(qiáng)度和良好的均勻性為25毫米的視圖中的一個(gè)領(lǐng)域，有一個(gè)額外的照明透鏡的組合。用戶(hù)誰(shuí)需要特別良好的均勻性，甚至有可能脫離的HC F模塊的照明透鏡，只是稍微降低的熒光強(qiáng)度。物鏡瞳孔中的光源的圖像規(guī)模為從11.5減少到約9.5的值，從而增加了約20％的有用的視場(chǎng)中。為了進(jìn)一步提高均勻性，光擴(kuò)散磁盤(pán)可以插入模塊。有趣的是，已經(jīng)觀察到最舒適的觀看熒光圖像的印象時(shí)，得到的圖像強(qiáng)度不完全是恒定的，而是稍微下降到圖像的邊緣。這種效果是由于眼睛的生理（所謂的“橫向相位差”）。相反，視頻圖像分析技術(shù)要求非常恒定的照度。這可以通過(guò)在HC RF模塊的光擴(kuò)散盤(pán)切換到視頻模式，從而導(dǎo)致更多的同質(zhì)性在中央領(lǐng)域約16毫米（對(duì)應(yīng)于所覆蓋的區(qū)域由一個(gè)1/2“攝像機(jī)與電視的適配器x0 .5）。

徠卡也進(jìn)一步改善的物鏡為熒光顯微鏡。光學(xué)眼鏡具有低自發(fā)熒光性能的選擇，在增強(qiáng)圖像的對(duì)比度。

熒光顯微鏡中的一個(gè)問(wèn)題是可以得到比較厚的標(biāo)本，沒(méi)有銳利的圖像。前焦距和后焦點(diǎn)的平面的不必要的貢獻(xiàn)，這是由于 - 使用具有高數(shù)值孔徑的物鏡 - 到最后的顯微鏡圖像。這將導(dǎo)致在更短的良好定義的圖像。徠卡光譜共焦顯微鏡然而獲得清晰的圖像在高分辨率幾個(gè)焦平面內(nèi)的樣品在高橫向和縱向分辨率。

標(biāo)本中分離的多個(gè)熒光染料的顏色得到了進(jìn)一步的提高頻譜分析。計(jì)算機(jī)輔助光譜共焦掃描顯微鏡也因此成為熒光顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)和材料研究的終極工具。

為各種應(yīng)用在分子生物學(xué)篩選立方體

在過(guò)去十年中的分子生物學(xué)應(yīng)用的爆炸已經(jīng)導(dǎo)致許多過(guò)濾器的各種應(yīng)用組合的發(fā)展?，F(xiàn)在，這些套過(guò)濾器安裝在一個(gè)大的變化濾光塊（塊）。熒光外延照明使2-8濾光塊手工操作或機(jī)動(dòng)交換交換，例如熒光雜交研究所需。本文的目的不是眾多的應(yīng)用程序啟用各種過(guò)濾立方體給予了全面而詳細(xì)的討論。而不是只具有過(guò)濾器的多維數(shù)據(jù)集和關(guān)鍵字給出的示意性概述，表示可能的應(yīng)用（表1）。

表1：實(shí)施例的熒光顯微鏡的應(yīng)用

當(dāng)他們?cè)谶@里列出被引用的論文中提到的光學(xué)部件和熒光染料。在此表中的用語(yǔ)和術(shù)語(yǔ)限制在文中所引用的論文中使用的術(shù)語(yǔ)。過(guò)濾器名稱(chēng)術(shù)語(yǔ)在德國(guó)上市斜體。作者可能被稱(chēng)為帶外干擾濾波器（BP）的半值寬度為要么如00/00納米，表示的中心波長(zhǎng)和半功率帶寬（例如，BP 525/20）或短期和長(zhǎng)期的波半功率點(diǎn)（如BP 450-490）。確定短期和長(zhǎng)期通濾波器由字母SP和LP和邊緣納米波長(zhǎng)（如SP，LP 520 490或> 520納米）。如果該參考文獻(xiàn)的作者的光學(xué)部件制造商，讀者可以參考所引用的文獻(xiàn)。

*排放或激光線。
^短傳SP（KP）激發(fā)濾光片窄帶通（BP）激發(fā)濾光片。多帶通濾波器（MBP）。 ％分色分束器（DBS）或分色鏡（DM）％? Polychroic束spitter（PBS）中。＃屏障過(guò)濾器（LP）。發(fā)射帶通（BP）的干涉濾光器，和發(fā)射多個(gè)帶通濾波器（MBP）。@篩選立方體，塊（FC）。

反射顯微鏡（RCM）

徠卡落射照明顯微鏡的發(fā)展已經(jīng)導(dǎo)致了進(jìn)一步的發(fā)展：反射顯微鏡。反射顯微鏡標(biāo)本染色與常規(guī)的吸收免疫學(xué)指標(biāo)如過(guò)氧化物酶-DAB，免疫金銀和免疫磷酸酶（圖10和圖11）提供了強(qiáng)有力的信號(hào)。由于強(qiáng)烈的信號(hào)
，可以得到-圖像對(duì)比度高的圖像并沒(méi)有惡化前和交的焦點(diǎn)圖像-薄切片，RCM滿(mǎn)足所有的理論光的最佳光顯微鏡的分辨率標(biāo)準(zhǔn)?？梢员欢x為高清晰度的圖像的光的結(jié)果。

圖 10：反射顯微鏡（RCM）。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞秉承蓋玻片和表面抗原的單克隆抗體染色。免疫組化染色。絲狀偽足的薄膜的擴(kuò)展，這是不明視野顯微鏡visisble，是可見(jiàn)的強(qiáng)relfection的DABox產(chǎn)品bccause的。

圖 11：超薄切片（約35 nm）的腎組織過(guò)氧化物酶DAB染色。反射顯微鏡觀察到腎小球的線性染色模式呈現(xiàn)往往比用熒光顯微鏡更清晰的圖像。

圖 12：過(guò)濾器的立方體（塊），用于反射顯微鏡，含有偏振片（50％），中性束器和分析儀。該過(guò)濾器的多維數(shù)據(jù)集（塊）可以被插入到一個(gè)熒光顯微鏡落射照明的Leica的位置。

大多數(shù)免疫組化染色的強(qiáng)反射，提供了這樣一個(gè)高對(duì)比度，這種染色可以結(jié)合很多經(jīng)典的（吸收）為重要的大分子，顯示出適度的強(qiáng)反射的組織化學(xué)染色。后者的污漬常常可以直接使用，提供良好的形態(tài)取向和在許多情況下，比單獨(dú)使用熒光標(biāo)記物來(lái)實(shí)現(xiàn)更精確的位置的immunomarker。此外，這樣的光顯微鏡觀察，可以確認(rèn)通過(guò)電子顯微鏡通過(guò)檢查下一個(gè)超薄切片（具有相同的免疫染色）與EM。

在共聚焦激光掃描顯微鏡中，RCM可以進(jìn)行，沒(méi)有特殊的或其他的雜散光減少光措施，由于消除雜散光被照明透過(guò)針孔。最吸引人的免疫染色得到一個(gè)非常強(qiáng)大的激光的反射和顯示非常有限褪色。他們往往允許一個(gè)小針孔的大?。ɡ?/span>10微米），這是小于約五到十倍可用于大多數(shù)熒光染料共聚焦熒光激光掃描技術(shù)顯微鏡的使用。因此，反射免疫學(xué)指標(biāo)的使用可以導(dǎo)致在光學(xué)分辨率的一個(gè)非常顯著的增加。標(biāo)本雙染既具有熒光和徠卡光譜共焦激光掃描顯微鏡提供了新的可能性多個(gè)標(biāo)記可以很容易地檢查反射immunomarker。

RCM使用熒光顯微鏡支架，落射照明器和高壓燈。一個(gè)額外的偏振器濾塊，包含偏振器，反射板，和分析器的熒光落射照明，必須插入（圖12）。另外一個(gè)反射對(duì)比度（RC）膜片模塊（包含中央停止系統(tǒng)）必須使入射光路。中央車(chē)站和/或光圈隔膜，這RC隔膜模塊適應(yīng)滑動(dòng)套。此外，反射顯微鏡開(kāi)發(fā)的一個(gè)特殊的物鏡，配備徠卡RC M-PLAN油浸x100/1.25 RCM物鏡的λ/ 4波片在鏡頭前，應(yīng)加一套物鏡（熒光顯微鏡）上炮塔物鏡的************。

在反射光顯微鏡，對(duì)比是基于不同的反射強(qiáng)度（反射率）。在這種類(lèi)型的顯微鏡，它應(yīng)該提醒的是，在每一個(gè)光學(xué)邊界發(fā)生光的反射，即當(dāng)?shù)?a title='折射率' target='_blank' class='seolabel'>折射率和/或吸收指數(shù)的變化。對(duì)于生物標(biāo)本示出反射率小于1％，并主要是小于0.2％，這幾乎是不可能取得的反射光圖像，用常規(guī)的顯微鏡，由于顯微鏡管內(nèi)的不必要的反射。在反射顯微鏡，使用兩種方法的組合，以減少眩光，由于散射光。入射光被制作成一個(gè)由一個(gè)中心站（與中央站提供，創(chuàng)建環(huán)形光闌的孔徑光闌）的入射光路徑與后焦距（光圈）的平面共軛的平面插入的光錐ringshaped的物鏡。作為第二方法，不想要的散射反射光減少所使用的“抗折”的的方法。通過(guò)使用正交偏光顯微鏡內(nèi)部的反射的光被抑制，其結(jié)果，從檢體被傳遞到眼睛反射的光。該物鏡設(shè)置有一個(gè)物鏡的四分之一波片，在前面的物鏡鏡頭。通過(guò)的光通過(guò)λ/ 4板（向下的試樣從試樣反射后向上）改變光的偏振方向，用2×45°= 90°。