在活細(xì)胞研究設(shè)計(jì)的光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)，主要考慮檢測(cè)器的靈敏度（信號(hào)與噪聲），圖像采集所需要的速度，以及標(biāo)本的可行性。相對(duì)較高的光照強(qiáng)度和較長(zhǎng)的曝光時(shí)間，通常采用固定的細(xì)胞和組織（如漂白是主要的考慮因素）中記錄圖像時(shí)，必須嚴(yán)格避免與活細(xì)胞。在幾乎所有的情況下，活細(xì)胞顯微代表了一種妥協(xié)之間實(shí)現(xiàn)最佳的圖像質(zhì)量和保持健康的細(xì)胞。不必要的過采樣的時(shí)間點(diǎn)，使細(xì)胞含量超標(biāo)的照明，空間分辨率和時(shí)間分辨率的實(shí)驗(yàn)，而不是應(yīng)限制在調(diào)查的物鏡相匹配的。

原則上，理想的活細(xì)胞圖像采集系統(tǒng)是不夠敏感，從弱熒光樣品，同時(shí)足夠快的速度來記錄所有動(dòng)態(tài)過程，獲得高品質(zhì)的圖像。此外，該系統(tǒng)將有足夠的分辨率捕捉最細(xì)微的標(biāo)本細(xì)節(jié)能夠準(zhǔn)確測(cè)量非常微小的差異在強(qiáng)度和較寬的動(dòng)態(tài)范圍。不幸的是，僅完成優(yōu)化這些條件中任一項(xiàng)在犧牲其他。因此，目前不可能設(shè)計(jì)一個(gè)通用的活細(xì)胞成像系統(tǒng)，這將是理想的整個(gè)范圍內(nèi)的可能的調(diào)查。相反，研究人員必須妥協(xié)，確定最重要的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)還試圖限制由這些變量被認(rèn)為不太感興趣的犧牲。顯微鏡配置在最后，最終確定所要求的攝像模式（s）時(shí)，生活必需品保持試樣在實(shí)驗(yàn)期間，標(biāo)記協(xié)議的難度級(jí)，和設(shè)備的可用性的可行性。

示于圖1，是一個(gè)現(xiàn)代的倒置研究級(jí)組織培養(yǎng)顯微鏡配備4相機(jī)端口，每個(gè)端口耦合到一個(gè)不同的相機(jī)設(shè)計(jì)用于特定的成像模式。在大多數(shù)情況下，這種設(shè)計(jì)直接是100％的端口（一個(gè)端口在同一時(shí)間）的光顯微鏡或分裂的相機(jī)端口和目鏡的光80:20之間。對(duì)于在低光照水平的關(guān)鍵的成像，研究者應(yīng)確保最敏感的相機(jī)被連接到一個(gè)端口接收由樣品發(fā)射的光100％。在圖1中，全彩色CCD相機(jī)連接到的底部端口（一）接收來自物鏡的光不反射的反射鏡或棱鏡，并在這種情況下，采用圖像乘以在明視場(chǎng)模式下的標(biāo)記的熒光的標(biāo)本（或染色標(biāo)本） 。高性能電子乘以數(shù)字（EMCCD）相機(jī)（二）安裝到右側(cè)端口上使用的圖像標(biāo)本顯示出非常低的水平的熒光。微分干涉對(duì)比成像深入厚的組織與紅外照明，照相機(jī)（（c）的左側(cè)端口））具有傳感器具有高的量子效率在700和1000納米之間是必需的。最后，用于高分辨率單色成像通過全內(nèi)反射和其他熒光技術(shù)，珀耳帖（Peltier）冷卻的攝像頭（（四）;前端口）相對(duì)小的像素（6微米）是理想的。的配置，如在圖1中所示的是昂貴的，但也可以是極其通用的核心成像設(shè)施。

使用廣泛的對(duì)比增強(qiáng)成像模式，在光學(xué)顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞成像。調(diào)查的大部分涉及某種形式的熒光顯微鏡，往往聯(lián)接到一個(gè)或多個(gè)發(fā)送的光技術(shù)。熒光技術(shù)，包括傳統(tǒng)的寬視場(chǎng)落射熒光，激光掃描共聚焦，旋轉(zhuǎn)盤，橫掃領(lǐng)域聚焦，多光子，全內(nèi)反射（TIRF），熒光相關(guān)光譜，熒光壽命成像（FLIM），光活化，和激光捕獲。作為一個(gè)子集，專門的成像方法，如多色成像，光譜成像，共定位，延時(shí)序列，漂白恢復(fù)技術(shù)（FRAP，FLIP FLAP），共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），斑點(diǎn)顯微鏡（FSM），膜片鉗往往是耦合到主成像模式中的一個(gè)或多個(gè)?？梢暂o以熒光技術(shù)傳統(tǒng)的明視場(chǎng)模式下，包括微分干涉相差（DIC），霍夫曼調(diào)制反差（HMC），相位相反的，作為熒光探針本地化的確認(rèn)。在幾乎所有情況下，每個(gè)的顯微鏡配置需要一些獨(dú)特的考慮，必須實(shí)現(xiàn)成功的活細(xì)胞成像。無(wú)論顯微鏡和成像活細(xì)胞和組織采用的數(shù)字照相機(jī)系統(tǒng)，兩個(gè)最重要的限制因素是維持細(xì)胞生存力和實(shí)現(xiàn)可能的最高信號(hào)電平以上的背景噪聲和自發(fā)熒光。

優(yōu)化信號(hào)與噪聲在活細(xì)胞成像

成像固定和活細(xì)胞之間的基本區(qū)別之一是，前者的研究者提供了充足的緯度定義圖像采集參數(shù)，如尋找一個(gè)合適的視野，并確定曝光時(shí)間，以及調(diào)整電子增益設(shè)置，讀出率，和偏移值。其結(jié)果是，它在大多數(shù)情況下是可能的（與充分染色固定標(biāo)本）獲取利用的全動(dòng)態(tài)范圍的照相機(jī)系統(tǒng)的圖像，從而產(chǎn)生最佳的信號(hào) - 噪聲比。不幸的是，情況是不同的成像參數(shù)所施加的嚴(yán)格要求，保持細(xì)胞活力，活細(xì)胞的限制。常常與活細(xì)胞的獲得的圖像中，試樣的強(qiáng)度只有幾個(gè)灰度級(jí)高于背景。在這種情況下，最重要的攝像考慮成為暗電流和讀出噪聲水平的檢測(cè)器系統(tǒng)。經(jīng)濟(jì)的相機(jī)通常具有更高的噪聲水平，導(dǎo)致經(jīng)常掩蓋從檢體，作為增加的讀出速度的效果越來越嚴(yán)重的信號(hào)不太均勻的背景圖像。在幾乎所有活細(xì)胞成像，探測(cè)器的選擇是最重要的成功或失敗的實(shí)驗(yàn)。

在數(shù)字成像的噪聲出現(xiàn)的四個(gè)主要來源來自檢測(cè)器，照明系統(tǒng)，泊松或拍攝的噪聲（由于一個(gè)光子通量的隨機(jī)性）和雜散光。在大多數(shù)情況下，系統(tǒng)的噪聲減少，可以實(shí)現(xiàn)通過仔細(xì)選擇的檢測(cè)器和優(yōu)化的照明條件。幾乎每一種類型的光子探測(cè)器到各測(cè)量記錄與設(shè)備引入某種形式的噪音。在激光掃描和多光子顯微鏡采用光電倍增管可以產(chǎn)生雜散的電子信號(hào)放大系統(tǒng)內(nèi)的。同樣地，使用的電荷耦合器件（CCD的）在寬視場(chǎng)，反卷積，內(nèi)部全反射，旋轉(zhuǎn)盤，和掃頻場(chǎng)顯微鏡顯示出暗電流與每個(gè)像素相關(guān)聯(lián)的背景。在CCD和光電倍增管設(shè)計(jì)的改進(jìn)，包括冷卻裝置，以非常低的溫度，減少了暗電流的貢獻(xiàn)，以非常低的水平。然而，尤其是在每個(gè)像素的CCD的情況下，閱讀和將模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字相當(dāng)于貢獻(xiàn)了額外的噪聲分量被稱為讀出噪聲，在當(dāng)前一代的冷卻的數(shù)碼相機(jī)系統(tǒng)的主要噪聲偽像。

如圖2所示，在活細(xì)胞成像與讀出速度和圖像質(zhì)量是相互依存的數(shù)字?jǐn)z像機(jī)的靈敏度。標(biāo)本是一種文化的人宮頸癌細(xì)胞（HeLa細(xì)胞線）表達(dá)的融合熒光蛋白基因和人α -微管蛋白的寬視場(chǎng)成像中的熒光照明與TRITC濾光鏡組合和灰度攝像系統(tǒng)工作在讀取速度，單體Kusabira橙色（人民圣戰(zhàn)者組織）10或1.25兆赫。當(dāng)相機(jī)CCD關(guān)門（接收沒有光），背景噪聲是顯著降低時(shí)，采用的讀出速度慢，在圖2（a）和2（b）在分別為10和1.25兆赫的速度，所描繪。這種差異不嚴(yán)重影響相機(jī)的性能時(shí)，曝光時(shí)間可以調(diào)整到利用的整個(gè)動(dòng)態(tài)范圍，如在圖2（c）和圖2（d）中提出的圖像類似的質(zhì)量證明。然而，在低光照條件下，讀取速度較慢（圖2（f））提供優(yōu)異的圖像質(zhì)量。在圖2（e）和2條（f）的圖像捕獲約低10倍比那些在圖2（c）和圖2（d）的光強(qiáng)度。減少的照度水平另一個(gè)5倍的產(chǎn)生的效果表現(xiàn)得更為明顯，如示于圖2（g）和2（h）中的讀出速度較慢提供了勉強(qiáng)可以接受的圖像（圖2（小時(shí)）），而快速讀出模式（圖2（g））沒有。

一個(gè)成功的數(shù)字成像實(shí)驗(yàn)需要的空間照明模式的標(biāo)本是恒定的整個(gè)視野之間連續(xù)的影像。根據(jù)照明源，橫跨試樣字段的光學(xué)性質(zhì)通常是相當(dāng)恒定的（稱為空間不變性）顯微鏡使用鎢鹵素?zé)?。然而，在激光掃描顯微鏡，傳送到一個(gè)特定的像素的照射劑量可以為每個(gè)掃描變化。此外，汞等離子弧放電燈源通常采用在寬視場(chǎng)熒光顯微鏡不提供均勻的強(qiáng)度，在整個(gè)頻譜，但在特定的波長(zhǎng)，而不是產(chǎn)生離散的高強(qiáng)度的峰。氙氣燈，與此相反，顯示出更為均勻分布的強(qiáng)度分布圖的可見光譜范圍內(nèi)，但在紫外區(qū)域（通常避免在活細(xì)胞成像的照明范圍）有缺陷。

組合弧放電燈（例如，金屬鹵化物燈），具有的屬性之間的中間的汞和氙的混合物，顯示出這兩個(gè)物種也許是最好的特性，除了提供一個(gè)連續(xù)的光譜，從紫外到紅外強(qiáng)大的汞線。不管的光源，照明場(chǎng)可呈現(xiàn)幾乎均勻的通過燈箱和顯微鏡光學(xué)火車照明輸入端口之間放置一個(gè)光學(xué)纖維（或液體光導(dǎo)）。任何剩余的照明梯度整個(gè)視野可以通過計(jì)算校正使用平場(chǎng)的算法。重要的是要注意，在燈的輸出功率的時(shí)間的變化，它可以改變從平均10％，不校正由光學(xué)纖維和需要的應(yīng)用程序的一個(gè)穩(wěn)定的電源。

光子通量的測(cè)量本質(zhì)上是一個(gè)統(tǒng)計(jì)過程中，與信號(hào)檢測(cè)的不確定性因素。稱為泊松或拍攝噪聲（如上面所述）的凈效果是，對(duì)于N個(gè)光子的測(cè)量，不確定性等于N，這也是的信號(hào)-噪聲比的平方根。最大化的信號(hào)的光子數(shù)（ N ）直接導(dǎo)致在信號(hào)與噪聲和圖像對(duì)比度的改進(jìn)。提高信號(hào)的最簡(jiǎn)單的方法是收集更多的光子，通常是通過采取更長(zhǎng)時(shí)間的曝光，或通過增加勵(lì)磁照明水平，但這些措施也可以增加光毒性和妥協(xié)細(xì)胞存活率。第二，也許更有益的選擇，是為了提高探測(cè)器的靈敏度。

為了克服低光水平與活細(xì)胞成像，現(xiàn)代數(shù)字CCD相機(jī)可以配置提供一個(gè)實(shí)施的過程被稱為分級(jí)（詳見圖3和圖8），顯著提高了靈敏度。在正常讀出時(shí)，在CCD的像素的量的水平像素的行轉(zhuǎn)移到讀取寄存器中，然后將其按順序分析。在一個(gè)離散化的圖像，在圖像傳感器上的基團(tuán)中，相鄰像素中鄰接的（例如，一個(gè)2×2或4×4塊）的信號(hào)（光電子）被合并，并分配到一個(gè)單一的象素值中讀出的數(shù)組。這是由多個(gè)平行的行的像素轉(zhuǎn)移到串行讀寄存器（例如，為2×2 binning和4行4×4像素合并兩行），然后讀取組的2，3，或多個(gè)像素一起實(shí)現(xiàn)。在2×2像素合并的情況下，有兩倍的分辨率損失，信號(hào)增加了四倍，和2倍的改善信號(hào)對(duì)噪聲。顯然，改善信號(hào)的有限的應(yīng)用中可以顯著，雖然在空間分辨率的成本。

圖3示出的效果相結(jié)合的相鄰像素上的空間分辨率和數(shù)字拍攝的圖像的最終尺寸，使用水平的不斷提高像素合并。標(biāo)本赤麂鹿皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)mCherry（pseudocolored紅色熒光蛋白）和人類的β -肌動(dòng)蛋白，它定位在應(yīng)力纖維組成的絲狀細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的融合是一種文化。作為與熒光蛋白標(biāo)簽，通常觀察到的細(xì)胞，顯示優(yōu)越的本地化往往是那些表達(dá)的融合產(chǎn)物，在非常低的水平，顯著降低了可用的信號(hào)。隨著沒有像素合并啟用（圖3（a）），該信號(hào)是太低，在曝光時(shí)間產(chǎn)生可忽略不計(jì)的光毒性和光漂白區(qū)分。像素合并2×2和4×4的逐漸增大的信號(hào)電平，但在成本的空間分辨率（圖3（b）和圖3（c））。最亮的圖像是由分級(jí)的8×8個(gè)像素（圖3（d）），但存在激烈的分辨率損失。很重要的一點(diǎn)需要注意的是，圖像尺寸按比例減少在分級(jí)過程相結(jié)合的像素?cái)?shù)增加。例如，在圖3中未像素合并（1×1）的圖像本來是1360×1024像素，而（2×2），（4×4），和（8×8）離散化圖像是680×512，340所述256，和170×128像素，分別。這些圖像已被縮小尺寸時(shí)，在圖中為了說明的目的。同樣地，數(shù)碼相機(jī)，具有512×512的顯示尺寸，會(huì)產(chǎn)生256×256，128×128，和64×64像素的圖像，當(dāng)以類似的方式裝倉(cāng)。

分級(jí)概念的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是，除了發(fā)生后的分選過程中，因此，即使幾個(gè)像素相結(jié)合，只有一個(gè)讀事件每股合并像素的讀出噪聲。相反，如果一個(gè)2×2的方塊的像素被計(jì)算數(shù)據(jù)收集后的平均值，其結(jié)果將是不如像素合并，因?yàn)橛伤膫€(gè)像素中的每一個(gè)的單獨(dú)的讀出的噪聲貢獻(xiàn)。因此，即使分級(jí)犧牲空間分辨率，它會(huì)導(dǎo)致到的信號(hào)噪聲比，一個(gè)特別有用的優(yōu)勢(shì)顯著增加時(shí)要求低光水平和較短的曝光時(shí)間上的光敏細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在活細(xì)胞成像的關(guān)鍵參數(shù)通常能夠檢測(cè)到微弱的熒光信號(hào)，而不是解決這些問題的空間，以便提供圖像采集的力度和速度的增加抵消了損失分辨率的分級(jí)多。作為一種替代方法，以分級(jí)，許多高性能相機(jī)使研究者通過閱讀只有一個(gè)子數(shù)組或利息完整的CCD陣列，空間分辨率的同時(shí)，減少量的一個(gè)有用的機(jī)制來保存選定區(qū)域，以減少圖像采集時(shí)間時(shí)間細(xì)胞暴露于有害的照明。

為了克服傳統(tǒng)的高性能CCD相機(jī)的應(yīng)用需求快速幀速率拍攝在非常低光水平的缺點(diǎn)，廠商都推出了一種創(chuàng)新的方法，以上的CCD讀出噪聲地板的微弱的信號(hào)放大。通過裝有一個(gè)片上的乘法增益寄存器，電子倍增的設(shè)備（EMCCDs）實(shí)現(xiàn)單光子的檢測(cè)靈敏度，典型的強(qiáng)化或電子轟擊CCD的低得多的成本和不損害傳統(tǒng)CCD結(jié)構(gòu)的量子效率和分辨率特性。EMCCDs的顯著特點(diǎn)是將一個(gè)專門的擴(kuò)展串行寄存器在傳感器芯片上，生成乘法增益硅子結(jié)構(gòu)（參見圖4）內(nèi)通過的過程中，碰撞電離。高于的光子產(chǎn)生的電荷被讀出的噪聲，即使在高的幀速率，并且是適用于任何當(dāng)前的CCD傳感器配置，包括背照式設(shè)備。

甲EMCCD相機(jī)系統(tǒng)的顯著優(yōu)點(diǎn)是，它們是相當(dāng)便宜制造比加劇的CCD，由于CCD的結(jié)構(gòu)被直接并入到信號(hào)放大級(jí)。對(duì)于關(guān)鍵的活細(xì)胞與低強(qiáng)度的信號(hào)，如單分子成像中所遇到的，總的內(nèi)部反射，旋轉(zhuǎn)盤和掃頻場(chǎng)共聚焦顯微鏡，鈣或其它離子的通量測(cè)定，和時(shí)間分辨三維顯微鏡調(diào)查EMCCD提供其他傳感器，專為低信號(hào)電平的顯著優(yōu)勢(shì)。此外，與傳統(tǒng)的熒光成像技術(shù)的較高的信號(hào)電平的時(shí)，的EMCCD系統(tǒng)允許的極端敏感性較低的熒光基團(tuán)的濃度和/或較低的功率電平，從激勵(lì)源的應(yīng)用程序，由此減小了光毒性和光漂白的熒光探針。

顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)

顯微鏡針對(duì)活細(xì)胞成像的應(yīng)用都必須配備一個(gè)高品質(zhì)的框架構(gòu)造堅(jiān)固的復(fù)合材料或鋁和應(yīng)穩(wěn)定牢固地安裝在無(wú)振動(dòng)的平臺(tái)。光學(xué)表面的外觀以及組件箱（冷凝器，燈箱，物鏡轉(zhuǎn)盤等）應(yīng)保持干凈的狀態(tài)和周圍環(huán)境的顯微鏡時(shí)，應(yīng)無(wú)粉塵和低相對(duì)濕度。其中連續(xù)是必要的活細(xì)胞成像的常規(guī)程序是確保顯微鏡光學(xué)通路和隔膜對(duì)齊使用科勒照明的原則。實(shí)驗(yàn)室房間的殼體顯微鏡的好處，以減少雜散光進(jìn)入通過目鏡的顯微鏡或所述試樣腔室的水平的能力，以減少所有開銷照明。

電子數(shù)碼相機(jī)系統(tǒng)通常安裝到顯微鏡主體通過使用專門的適配器的一個(gè)或多個(gè)攝像頭端口。研究級(jí)顯微鏡通常配備多個(gè)端口，能夠同時(shí)連接多臺(tái)攝像機(jī)（見圖1）。顯微鏡，采用多種成像模式，使相機(jī)的優(yōu)化配置，為每個(gè)對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)，可以快速訪問在必要時(shí)，此功能特別有用。在顯微鏡主體內(nèi)，反射鏡，分光鏡，和棱鏡的級(jí)聯(lián)策略性定位，以反映圖像形成光波的相機(jī)的各種端口和目鏡。重要的是要注意，任何圖像采集期間發(fā)送到目鏡光這樣做在發(fā)送到照相機(jī)的光的犧牲，從而減少了信號(hào) - 噪聲電平。因此，在顯微鏡配備的，口方向控制應(yīng)調(diào)整到100％的光發(fā)送到相機(jī)端口，用于收購(gòu)有限光子熒光圖像。

收集從檢體的最大的信號(hào)，并將其傳送到顯微鏡光學(xué)列車的物鏡的選擇是至關(guān)重要的。的光路中，作為反射鏡，分束器，投影透鏡，濾光鏡，和棱鏡等的元素?cái)?shù)量過多會(huì)嚴(yán)重的降低信號(hào)被捕獲圖像中的噪聲電平必須保持在絕對(duì)最小值。在熒光成像，需要具有非常高的數(shù)值孔徑的物鏡是從檢體收集到的光的量最大化。數(shù)值孔徑，它定義了多少可以收集從一個(gè)單一的點(diǎn)光源的光的鏡頭，可以說是最重要的考慮因素，在選擇活細(xì)胞成像的物鏡。從低倍率（10倍）干物鏡油浸版本（通過100倍40倍）水和1.45 1.20 0.25，此值上刻的客觀桶和范圍。在數(shù)學(xué)術(shù)語(yǔ)中，數(shù)值孔徑被表示為：

數(shù)值孔徑（NA）=折射率（η）×鏡頭受光角（罪（θ））

因此，由前透鏡之間的介質(zhì)和能夠有助于最大衍射光線的角度（θ）的正弦乘以試樣的折射率（η）確定的光收集能力的客觀圖像形成。此外，生成的圖像的分辨率，由物鏡的數(shù)值孔徑是一個(gè)函數(shù)。根據(jù)瑞利判據(jù)（一個(gè)保守的估計(jì)），分辨率是等于一個(gè)常數(shù)（0.61）的照明的波長(zhǎng)乘以除以由物鏡的數(shù)值孔徑。另外，數(shù)值孔徑定義的強(qiáng)度（亮度）的圖像，這是與數(shù)值孔徑的四次冪成正比，但只成反比的，與放大倍數(shù)的第二功率。因此，小的數(shù)值孔徑的增加可以產(chǎn)生顯著的改善信號(hào)。出于這個(gè)原因，活細(xì)胞的熒光成像通常需要最高的數(shù)值孔徑耦合到高折射率浸沒介質(zhì)（油或水）的物鏡。

如上所討論的，所述信號(hào)的亮度的物鏡放大倍率的平方成反比，所以，低倍率物鏡時(shí)，往往是有益的暗淡的樣品成像。例如，如果信號(hào) - 噪聲比成為改變到類似的數(shù)值孔徑的60倍或40倍的物鏡將提供顯著的改善的亮度的數(shù)值孔徑1.4，用100倍的物鏡成像的標(biāo)本中的限制因素。事實(shí)上，一個(gè)特定的熒光特性幾乎應(yīng)該出現(xiàn)三次更明亮?xí)r，相對(duì)于100倍的物鏡（包括具有的數(shù)值孔徑為1.4）的具有60x的成像。所觀察到的強(qiáng)度也是一個(gè)函數(shù)變化的物鏡的傳輸質(zhì)量，它始終是值得考慮的放大率和binning在一起，以便評(píng)估一個(gè)特定的實(shí)驗(yàn)中所需的最終倍率。

對(duì)于成像乘法標(biāo)記的固定細(xì)胞（和在某些情況下，活細(xì)胞），在整個(gè)可見光光譜（范圍從400到700納米;稱為復(fù)消色差）良好地校正色差，具有平坦的成像平面（稱為平場(chǎng)物鏡或平光）被認(rèn)為是理想的。不幸的是，復(fù)消色差和平場(chǎng)復(fù)消色差的物鏡，以及那些，用來捕捉更廣闊的視野，不可避免地含有多個(gè)光學(xué)元件（透鏡）的比不太精確的物鏡（消色差透鏡和熒光）。高度的校正使這些物鏡，用于透射光的技術(shù)，包括以最小的工件的相對(duì)比度和DIC。的結(jié)果，但是，光吞吐量犧牲，以獲得最佳的光學(xué)矯正，因此，有固定細(xì)胞成像的影響不大，但往往是反效果的活細(xì)胞成像。不足之處是最好的證明的平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡40倍的物鏡有一個(gè)高數(shù)值孔徑為1.4，理論上應(yīng)該約6倍的亮度比一個(gè)類似的100倍的物鏡，是在實(shí)踐中只有約4倍，明亮的。無(wú)論如何，40x和60x的物鏡仍然提供了明亮的圖像可以實(shí)現(xiàn)光學(xué)分辨率的限制。

圖5中示出的數(shù)值孔徑的分辨率和圖像的亮度方面的重要性的一個(gè)例子的原理。的標(biāo)本是文化附著的非洲綠猴腎上皮細(xì)胞（CV-1線）的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染增強(qiáng)型綠色熒光融合蛋白的線粒體定位的核苷酸序列，細(xì)胞色素C氧化酶亞基第八。的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物宿主的轉(zhuǎn)錄和翻譯后，線粒體定位信號(hào)是負(fù)責(zé)運(yùn)輸和分配的熒光蛋白嵌合體整個(gè)蜂窩線粒體網(wǎng)絡(luò)。管狀線粒體，隨后可應(yīng)用熒光顯微鏡。

在圖5中，相同視野，使用具有相同的光學(xué)校正（平場(chǎng)熒光）和數(shù)值孔徑（1.3）的物鏡成像，但放大倍率從40倍到100倍不等。雖然利用在圖5中收集的圖像的像素和檢測(cè)器的條件的數(shù)目是相同的，線粒體最亮?xí)r，通過40倍的物鏡（圖5（a）;請(qǐng)注意，圖像已被調(diào)整到一個(gè)共同的的大?。┏上?。與此相反，更高的放大倍率60倍和100倍的物鏡（圖5（b）和圖5（c）中，分別）產(chǎn)生逐漸變暗的圖像，用100倍的圖像被幾乎不可見。這一物鏡仍然可以用作圖像試樣，但檢測(cè)器的增益，必須顯著增加，導(dǎo)致的信號(hào) - 噪聲比和通常次于圖像的劣化。請(qǐng)注意，由于在相同的數(shù)值孔徑值的物鏡的分辨能力（圖5（d）至圖5（f））是可比。

從圖5中的數(shù)據(jù)，將收集到的主要概念之一是為了避免過度放大時(shí)，選擇物鏡為活細(xì)胞成像熒光蛋白（和其它熒光基團(tuán)，對(duì)這一問題）。簡(jiǎn)單地增加了數(shù)字放大（變焦），在激光共聚焦顯微鏡圖像采集，圖像大小相當(dāng)于100倍鏡頭（圖5（D）和5（e））使用40x或60x的客觀結(jié)果。這兩個(gè)物鏡的分辨率是一樣的，因?yàn)樗麄冇邢嗤臄?shù)值孔徑。不應(yīng)該采取的觀點(diǎn)相對(duì)次要的放大表明，使用60倍或100倍的物鏡是不利于。事實(shí)上，選擇的高倍率的物鏡通常是必要的成像時(shí)非常小的物體，如過氧化物酶體或分泌顆粒，使用廣角鏡。由于相對(duì)于檢測(cè)器的尺寸的圖像尺寸起著重要的作用，在確定空間采樣頻率，最佳倍率確定的參數(shù)的數(shù)字照相機(jī)系統(tǒng)（CCD像素尺寸和中間倍率）。因此，最好的選擇的物鏡通常依賴于檢測(cè)儀器的光學(xué)配置，除了特定的實(shí)驗(yàn)的具體要求。

在的情況下的信號(hào) - 噪聲比的分辨率更為關(guān)鍵，它常常是一種更好的選擇，利用物鏡下校正（更少的光學(xué)元件），具有顯著較高的光吞吐量。時(shí)，應(yīng)注意也可用于通過包含顯著降低光透射的光學(xué)元件，如在相襯物鏡的振幅減小板的物鏡成像。此級(jí)別的光減少很少是傳輸模式中的一個(gè)問題，但可以大幅降低的信號(hào)電平（由15％至20％），在熒光成像。出于這個(gè)原因，相物鏡不應(yīng)該被用于活細(xì)胞成像的低豐度的探頭除非實(shí)驗(yàn)協(xié)議要求的相襯和熒光圖像的疊加。類似地，當(dāng)組合使用熒光和DIC的圖像正在收集，偏振光分析儀（其中約30％，降低了信號(hào)）通常是在共用的光路定位物鏡下方的立即和獲取熒光圖像之前，應(yīng)除去。

顯微鏡光學(xué)火車存在的任何缺陷將影響在最終圖像中的信號(hào)噪聲比。在活細(xì)胞成像與高數(shù)值孔徑物鏡，球面像差是最常見的神器，必須加以克服。此像差產(chǎn)生從洗澡的細(xì)胞（通常的折射率為1.33的水溶液）和客觀浸沒介質(zhì)的折射率的介質(zhì)之間的不匹配。球面像差通常本身表現(xiàn)為不均勻散布在焦點(diǎn)沿著光軸的圖像的一個(gè)點(diǎn)，使得顯著伸長(zhǎng)和扭曲。由于該信號(hào)被分布在一個(gè)更大的體積，其像差的存在下，信號(hào) - 噪聲比減少。此問題是更為嚴(yán)重的成像時(shí)比它是與蓋玻片上的貼壁細(xì)胞（通常只有幾微米厚），并可以通過使用水的浸沒透鏡是更密切地相匹配的折射率，在很大程度上消除了深成厚組織培養(yǎng)基中。作為一種替代方法，浸沒介質(zhì)的折射率或蓋玻片的厚度可以調(diào)整。重要的是要注意，折射率隨溫度的變化，因此，液浸介質(zhì)的最優(yōu)組合，和蓋玻片厚度會(huì)有所不同攝氏室溫和37度之間。較新的浸漬用校正鋌物鏡可以用來對(duì)抗由溫度引起的折射率的波動(dòng)。

圖6給出的顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)（面板（*））和檢測(cè)器（數(shù)碼相機(jī)，圖（b）），在執(zhí)行活細(xì)胞調(diào)查的是顯著的局限性。的檢體是由一個(gè)單一的間期細(xì)胞核的粘合大鼠袋鼠腎上皮細(xì)胞（PTK2線）表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的稠合的的蛋白H2B序列（其定位在細(xì)胞核中），并與外延懷德菲爾德熒光成像照明。下部的右側(cè)角面板（一）中的光學(xué)系統(tǒng)，并在較低的左上角的圖（b）的數(shù)字照相機(jī)系統(tǒng)的最高分辨率的圖像。在活細(xì)胞的顯微鏡，光學(xué)系統(tǒng)確定供對(duì)比度生成，以及規(guī)定的物理分辨率的限制，它是由物鏡的數(shù)值孔徑和波長(zhǎng)的照明設(shè)置的光的數(shù)量。作為照明強(qiáng)度的增加（運(yùn)行在面板（*）從頂部到底部），光子計(jì)數(shù)噪聲變得不那么明顯，圖像質(zhì)量顯著提高。同樣，作為增加的光學(xué)分辨率（左面板（*）中的右邊），更小的細(xì)節(jié)的細(xì)胞核變得更加顯而易見。

數(shù)字照相機(jī)系統(tǒng)捕獲從顯微鏡和數(shù)據(jù)根據(jù)離散的光水平和空間分辨率的元素（圖（b），圖6）的樣品的光信息。像素尺寸的增加（左右圖（b）），眾多功能的小細(xì)節(jié)變得模糊和圖像獲取一個(gè)塊狀的，幾乎不可見的外觀（右下角的角落里圖（b））。降低利用捕獲和顯示的圖像（在圖（b）中的頂部的底部）的灰度級(jí)的數(shù)目減少的陰影，只留下的功能具有非常高的對(duì)比度（在圖（b）中的頂行）。請(qǐng)注意，這兩個(gè)因素共同作用提供信息。再次，在活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，收集的信息應(yīng)該是成正比的要求的調(diào)查。

各種濾光鏡和反射鏡設(shè)計(jì)的活細(xì)胞成像的顯微鏡直接和微調(diào)照明和發(fā)光波長(zhǎng)的檔案，因?yàn)樗鼜墓庠赐ㄟ^顯微鏡（標(biāo)本），然后到檢測(cè)器。與對(duì)比度增強(qiáng)的光學(xué)系統(tǒng)在傳輸模式中，改性光組件或偏振片和棱鏡（DIC）或冷凝器環(huán)空中和相位環(huán)（相襯和Hoffman調(diào)制對(duì)比度）。由于光在顯微鏡光學(xué)火車明場(chǎng)，DIC，和相襯的整體吞吐量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于用熒光，通常是必要的，以增加信號(hào)噪聲很小的修改，當(dāng)在這些模式中的成像。主要考慮的是過濾的鎢鹵素?zé)粽彰?，以消除光毒性紫外線和紅外線的波長(zhǎng)，才損壞試樣。阻止紅外光，是必要的，以避免熱損傷的細(xì)胞，以減少?gòu)?fù)雜的信號(hào) - 噪聲與紅外線敏感的相機(jī)系統(tǒng)的背景水平。紫外線是更少的用透射光燈的關(guān)注，但使用的綠色或紅色的干涉濾光器，可以容易地控制試樣的波長(zhǎng)達(dá)到。兩個(gè)紅外線和可見光濾光鏡將顯著減少光的水平，并可能需要增加曝光和增益設(shè)置的檢測(cè)器系統(tǒng)上，以保持信號(hào) - 噪聲。

在熒光成像，干涉濾光片和二色性反射鏡的組合來選擇合適的波長(zhǎng)頻帶的光，用于激勵(lì)和收集從熒光團(tuán)標(biāo)記試樣排放。在熒光顯微鏡中，相對(duì)低光照水平相比，傳輸模式時(shí)，呈現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)足夠的信號(hào) - 噪聲水平的關(guān)鍵的選擇的濾光鏡。在大多數(shù)情況下，尤其是在信號(hào)泄放通過關(guān)注的問題是由于重疊的熒光團(tuán)發(fā)射的檔案，帶通激發(fā)和發(fā)射（阻擋層）濾光鏡的應(yīng)用是必需的。通常情況下，在這些濾光鏡中的固有的窄的光譜窗口進(jìn)一步限制通過的光量通過顯微鏡觀察，挑戰(zhàn)研究者用于獲得良好的圖像，來選擇最佳帶寬。

各種各樣的具體的帶通濾光鏡和二色鏡組合的顯微鏡制造商和濾光鏡售后光學(xué)公司。對(duì)于最佳的信號(hào)與噪聲的，選擇的濾光鏡的組合為活細(xì)胞成像應(yīng)密切匹配的實(shí)驗(yàn)中所用的熒光光譜檔案。例如，使用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的熒光素（FITC）濾光鏡集的多色標(biāo)記的應(yīng)用程序中的圖像細(xì)胞表達(dá)本身會(huì)不必要地犧牲一些YFP的熒光黃色熒光蛋白（YFP），否則將改善的信號(hào)-噪聲（設(shè)計(jì)參見圖7（a））。在這種情況下，匹配濾光鏡與適當(dāng)寬的帶通激發(fā)YFP的吸收和發(fā)射公司產(chǎn)生顯著更高的信號(hào)耦合到一個(gè)長(zhǎng)通發(fā)射濾光片。

優(yōu)化熒光濾光器的組合，以獲得盡可能高的信號(hào)電平的一個(gè)例子，提出了在圖7中的兩個(gè)常用的熒光蛋白衍生物。頂部面板（圖7（a）和圖7（b））示出的吸收和發(fā)射光譜金星，位點(diǎn)定向誘變產(chǎn)物YFP，疊加超過FITC標(biāo)記的濾光鏡組（圖7的（a）），以及一個(gè)專門的寬帶組合旨在最大限度地采集的信號(hào)，在一般情況下，從黃色熒光蛋白（圖7（b））。雖然發(fā)射濾光鏡與問候到檢測(cè)器發(fā)送的信號(hào)的電平相媲美，金星的吸收光譜，和異硫氰酸熒光素的激發(fā)濾光片帶通區(qū)域是顯著小于寬帶YFP集觀察之間重疊，導(dǎo)致低效的激勵(lì)和減少信號(hào)。同樣，TRITC濾光器組合（圖圖7（c））不激發(fā)mCherry熒光蛋白的效率作為得克薩斯紅集（圖圖7（d））。此外，在得克薩斯紅組合的發(fā)射濾光鏡的更寬的帶寬通過更多的信號(hào)的檢測(cè)器。關(guān)于選定的濾光鏡組合應(yīng)仔細(xì)檢查每個(gè)活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中使用的熒光激發(fā)和發(fā)射，以確保最高的效率。

除了設(shè)計(jì)單個(gè)熒光圖像的標(biāo)準(zhǔn)濾光鏡的組合，多頻帶集現(xiàn)在隨時(shí)提供給能夠同時(shí)與兩個(gè)或更多的熒光探針標(biāo)記的試樣的照明和探測(cè)。其他因素時(shí)，必須考慮微調(diào)顯微鏡的光學(xué)列車是中性密度濾鏡的戰(zhàn)略定位，激發(fā)照度水平（活細(xì)胞熒光成像的關(guān)鍵），以及紫外線和紅外線濾光鏡，以減少抵消或消除樣品光毒性。這些濾光鏡通常置于之間的電弧放電（或激光）的照明源和顯微鏡的輸入光端口，并且可以很容易地互換，以優(yōu)化光的吞吐量。通過顯微鏡的光通過的強(qiáng)度和數(shù)值孔徑也可以通過仔細(xì)調(diào)整的冷凝器或落射照明光圈和視場(chǎng)光闌調(diào)節(jié)。

光學(xué)分辨率探測(cè)器的幾何形狀相匹配

只要有足夠的采樣由檢測(cè)器系統(tǒng)的光學(xué)圖象，在顯微鏡下拍攝到的圖像的空間分辨率通常被定義的光學(xué)系統(tǒng)的分辨率。由于從每個(gè)都具有一個(gè)固定的大小的光電二極管的陣列構(gòu)成的CCD探測(cè)器，幾何形狀的各個(gè)像素可以限制最終的分辨率的圖像。為了實(shí)現(xiàn)大的分辨能力的顯微鏡，檢測(cè)器的尺寸應(yīng)符合每個(gè)艾里斑單元為2.5?3像素的奈奎斯特采樣準(zhǔn)則。作為一個(gè)例子，250納米的光學(xué)分辨率極限，在最終圖像中的像素的大小應(yīng)是約80至100納米。在活細(xì)胞成像，信號(hào)噪聲比光學(xué)分辨率往往是更重要的，最有用的限制收集圖像沒有明顯的退化是每艾里斑的2個(gè)像素。減少每艾里單元的像素的數(shù)量增加的亮度的圖像，并使得能夠使用較大的CCD光電二極管，可以積累更多的光電子。

圖8所示的（a）是通常用在投影到CCD像素陣列的表面的活細(xì)胞成像的高數(shù)值孔徑的物鏡的艾里磁盤從圖像。陣列中的每個(gè)像素的尺寸為6微米。的100倍的物鏡，用1.4的數(shù)值孔徑，將圖像投影到CCD表面直徑是20微米（見表1），從而容易地實(shí)現(xiàn)奈奎斯特采樣大小（3.3像素每個(gè)艾里單元）。在本次抽查頻率，留有足夠的余量，幾乎滿足奈奎斯特準(zhǔn)則，甚至用2×2像素組合。相比之下，60x的物鏡（也1.4數(shù)值孔徑）的投影圖像是12微米的直徑，僅低于奈奎斯特限制的下邊界。另外，即使減小數(shù)值孔徑為1.3，在40倍的物鏡產(chǎn)生一個(gè)8.4微米的圖像，將需要一個(gè)放大鏡照相機(jī)適配器符合奈奎斯特分辨率標(biāo)準(zhǔn)。光電二極管陣列具有更大或更小的像素尺寸相匹配的光學(xué)分辨率，沒有中間放大的顯微鏡，或用專門的CCD適配器，其中包含合適的鏡頭系統(tǒng)，可以輕松地修改。

甲的2×2像素binning示意圖在圖8（b）為一個(gè)包含16個(gè)像素的陣列。的光電子在曝光期間積累后，相機(jī)讀出電路執(zhí)行兩個(gè)連續(xù)的4個(gè)象素，每個(gè)象素的平行移動(dòng)。隨后，兩個(gè)串行寄存器位移的1個(gè)像素的地方收集的4個(gè)像素（2×2像素合并）到它們的電壓的輸出節(jié)點(diǎn)，其中讀出放大器的光電子。在類似的方式中，4×4像素合并（圖中未示出）將在整個(gè)16個(gè)像素陣列中的內(nèi)容轉(zhuǎn)移到輸出節(jié)點(diǎn)，在讀出之前，顯著增加了，同時(shí)減少了讀出噪聲的信號(hào)。正如前面所討論的，像素binning是一個(gè)極好的方法來檢索弱信號(hào)時(shí)，檢查在低表達(dá)水平降低毒性工件所需標(biāo)記的熒光蛋白的活體標(biāo)本。

在實(shí)踐中，理想的像素大小在最終圖像中具有的數(shù)值孔徑為1.4的一個(gè)物鏡是在100納米和120納米之間。這個(gè)數(shù)字翻譯成相應(yīng)的物理尺寸的CCD光電二極管，需要考慮的放大倍數(shù)為物鏡。例如，為了實(shí)現(xiàn)為60x的物鏡（1.4數(shù)值孔徑）的完整的光學(xué)分辨率的檢測(cè)器必須具有一個(gè)光電二極管6微米或更小的大小的（確定的倍率和分辨率的乘積）。然而，對(duì)于相同的數(shù)值孔徑的100倍的物鏡，最佳的光電二極管的大小被增加至10微米。因此，顯而易見的是，僅一個(gè)特定的CCD攝像機(jī)的數(shù)字分辨率匹配的顯微鏡的光學(xué)分辨率，當(dāng)相機(jī)被適當(dāng)?shù)芈?lián)接到適當(dāng)?shù)?/span>物鏡。交配的CCD照相機(jī)，具有10微米的光電二極管，以100倍的物鏡，將導(dǎo)致在一個(gè)最終的像素大小的圖像（100納米）。相同的相機(jī)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生167納米的像素用一個(gè)60倍的物鏡，這限制了在一定程度上記錄的圖像分辨率。與此相反，與6微米的光電二極管的CCD將被完全匹配到60x的物鏡，但會(huì)產(chǎn)生過采樣的圖像時(shí)，顯微鏡物鏡轉(zhuǎn)換器是旋轉(zhuǎn)插入的100倍的物鏡。過采樣在這種方式中，將顯著地降低圖像的亮度的同時(shí)，不能提高分辨率。

從前面的討論，它似乎唯一相匹配的檢測(cè)器的像素分辨率的顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的理想的解決方案是使用針對(duì)每個(gè)物鏡的不同的攝像機(jī)。在實(shí)踐中，很明顯，這種策略是不現(xiàn)實(shí)的，必須找到一個(gè)妥協(xié)的單相機(jī)系統(tǒng)優(yōu)化工具。在某些情況下，通過安裝的客觀時(shí)間倍率的顯微鏡和照相機(jī)之間的耦合器的分辨率的問題，可以規(guī)避。例如，一個(gè)0.6倍的耦合適配器將降低投影圖像的倍率從100倍的物鏡是相同的一個(gè)60x的物鏡。各種各樣的耦合器提供的售后分銷商增加或減少的CCD光電二極管陣列平面的投影放大。轉(zhuǎn)乘半信半疑上述建議的數(shù)字CCD攝像機(jī)方面，重要的是要注意，雖然這些器件可以相對(duì)容易地從顯微鏡，除去它是優(yōu)選離開將相機(jī)安裝在顯微鏡的端口，以防止灰塵和碎屑進(jìn)入身體的顯微鏡和從附著在攝像機(jī)圖像的傳感器窗口（靜電促進(jìn)的工件）。清潔傳感器面板窗口是一個(gè)異常困難的任務(wù)，特別是當(dāng)物鏡是完全刪除的每一個(gè)粒子的灰塵。

像素大小的要求比對(duì)顯微鏡的光學(xué)分辨率

表1

目前的高性能數(shù)碼相機(jī)系統(tǒng)設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡光電二極管尺寸從5至16微米，具有片上分級(jí)。如上所討論的，像素合并功能使從幾個(gè)相鄰的光電二極管的電荷被合并成一個(gè)較大的單位，有效地增加了的像素的大小。在6至8微米的光電二極管的尺寸范圍的攝像機(jī)，充分顯微鏡光學(xué)分辨率通?？梢员黄ヅ涫褂?/span>60x的物鏡沒有像素合并，而與100倍的物鏡，以提高圖像的亮度可以利用像素合并成一個(gè)2×2陣列的光電二極管。除了利用匹配的光學(xué)系統(tǒng)分辨率的CCD，使用更高的傳輸60x的物鏡，這種方法允許更明亮的圖像時(shí)，使用100倍的物鏡結(jié)合分級(jí)（2×2像素組合提高了靈敏度4倍）。其結(jié)果是，用100倍的物鏡記錄圖像，在紙槽2是大約兩倍與60x的物鏡沒有像素合并作為記錄的圖像的亮（及同等或更好的分辨率）。在額外的靈敏度的情況下，需要或必要時(shí)，可以60倍的物鏡分級(jí)2×2的亮度增加了四倍并發(fā)損失通常是可以接受的決議，對(duì)于大多數(shù)活細(xì)胞成像調(diào)查。

在一些應(yīng)用中，如那些需要一個(gè)大的細(xì)胞種群的同時(shí)監(jiān)測(cè)，捕獲的較大部分的視野是更重要的空間分辨率。該矩形的CCD圖像傳感器，在數(shù)碼相機(jī)中，沒有中間倍率不捕獲整個(gè)視場(chǎng)的通過顯微鏡目鏡作為可視化的，而是它被限制為30％和80％之間的范圍內(nèi)，取決于芯片尺寸。是必需的，如果一個(gè)較大的視野耦合適配器（如上所述），可以采用時(shí)間倍率。在許多情況下，一個(gè)0.6倍的中繼透鏡將投影的圖像的大小，其值接近在目鏡看到的視圖，但在一定的成本在分辨率。或者，為了保持分辨率，相鄰的字段的多個(gè)圖像可以聚集在高放大倍率使用x - ?機(jī)動(dòng)掃描階段和隨后縫合在一起成一個(gè)較大的圖像使用采集后處理軟件。

在光學(xué)顯微鏡的最大的分辨能力，實(shí)現(xiàn)與近紫外光，最短的有效成像波長(zhǎng)。其次是藍(lán)色，綠色，最后變?yōu)榧t色光的能力，以解決樣本的詳細(xì)近紫外光。在大多數(shù)情況下，顯微鏡使用廣譜白色的光所產(chǎn)生的鎢鹵燈泡照亮標(biāo)本，但在活細(xì)胞成像的照明的頻譜通常僅限于通過窄帶干涉濾光片的應(yīng)用。在可見光光譜的中心在約550納米，主波長(zhǎng)為綠色光（人眼最敏感的綠色光）。它是這樣的波長(zhǎng)，被用來計(jì)算分辨率值示于表1，所以這些值將不同當(dāng)利用較高或較低的波長(zhǎng)的光時(shí)，。的數(shù)值孔徑值也是重要的，更高的數(shù)值孔徑也將產(chǎn)生更高的分辨率，可以觀察到的物鏡表中的類似的倍率。

結(jié)論

也許最關(guān)鍵的活細(xì)胞成像方面實(shí)現(xiàn)最佳平衡信號(hào)強(qiáng)度低倍率的青睞，分辨率（放大倍率越高，所青睞），和細(xì)胞活力的放大倍率，同時(shí)在試驗(yàn)過程中。調(diào)查員必須密切注意，以配合最終的像素大小的探測(cè)器，利用盡可能少的鏡片的光學(xué)放大倍率。光學(xué)耦合器，具有各種各樣的中間放大系數(shù)是市售匹配兩個(gè)光限制和高分辨率的應(yīng)用程序的特定的客觀要求（倍率和數(shù)值孔徑）。Nyquist分辨率標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格選擇的物鏡放大倍率。每個(gè)像素應(yīng)該對(duì)應(yīng)于不超過一半所需的分辨率的限制，由于在顯微鏡的衍射極限，此距離應(yīng)不小于50納米的大多數(shù)應(yīng)用程序。

干部的活細(xì)胞成像顯微鏡的物鏡通常采用的標(biāo)準(zhǔn)是10倍和40倍（干），以及40X，60X和100X的油或水浸泡版本。經(jīng)濟(jì)型干式低倍率的鏡頭主要用于標(biāo)本的初步掃描，以找到感興趣的領(lǐng)域和不需要的高光校正因素。然而，浸沒透鏡應(yīng)設(shè)有高的數(shù)值孔徑（1.3至1.45的油和水為1.2）和高的光透射效率。由于圖像通常聚集的中心附近的視野，高度校正的物鏡，這些物鏡通常產(chǎn)生一個(gè)平面場(chǎng)提供沒有可檢測(cè)到的好處是明顯更昂貴的和更少的光效率比少許校正物鏡。用于熒光成像物鏡應(yīng)檢查的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)使用熒光微球的質(zhì)量。

冷卻單色CCD相機(jī)是最好的選擇，對(duì)于大多數(shù)成像應(yīng)用領(lǐng)域涉及文化的活細(xì)胞，無(wú)論是否落射熒光還是透射光對(duì)比度增強(qiáng)（DIC和相襯）是主要的收購(gòu)模式。在選擇相機(jī)時(shí)，考慮的重要參數(shù)，包括量子效率，噪音水平（暗電流和讀出），像素大?。ㄒ约跋嚓P(guān)的全井產(chǎn)能），并掃描頻率。為了盡量減少水平的激發(fā)光，照射在試樣上，相機(jī)應(yīng)該盡可能敏感，這通常意味著量子效率高，噪聲低，大的像素尺寸，和慢的掃描速率。靈敏度因此，必須對(duì)所要求的分辨率（青睞大量的更小的像素）和物鏡成像率（由較高掃描頻率的青睞）平衡。

慢掃描CCD相機(jī)一般都在他們的幀速率的限制，此外，樣本，除非有非常明亮的熒光，信號(hào) - 噪聲比是差時(shí)的曝光時(shí)間短。這限制了使用這些攝像機(jī)系統(tǒng)的高速成像應(yīng)用程序（高達(dá)每秒30幀），和挫敗嘗試聚焦樣本。應(yīng)努力以避免漂白和光毒性，可能會(huì)損害細(xì)胞的活力和亮度的工件，當(dāng)找到一個(gè)合適的標(biāo)本和對(duì)焦的攝像頭。在這方面，應(yīng)選擇相機(jī)功能無(wú)快門，幀傳輸或隔行掃描CCD傳感器，這是能夠提供除了慢掃描數(shù)字信號(hào)的圖像在視頻速率的連續(xù)流。極端低光照條件下，熒光探針顯示有限的豐度或低的量子產(chǎn)率，再加上捕捉高速運(yùn)動(dòng)的要求，有必要強(qiáng)化或電子倍增CCD相機(jī)系統(tǒng)使用。